Facteurs influençant la fertilité du sperme utilisé pour l’insémination artificielle et la fécondation in vitro

La fertilité des doses de sperme utilisées en insémination artificielle (IA) et en fécondation in vitro (FIV) est influencée par divers facteurs, notamment les caractéristiques biologiques des spermatozoïdes et les conditions techniques d’utilisation. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés en matière de reproduction assistée chez les équidés, de nombreuses questions restent ouvertes, notamment sur les mécanismes de sélection et de capacitation des spermatozoïdes. Cet article explore les principaux facteurs liés aux doses de sperme qui influencent la réussite de l’IA et de la FIV, tout en mettant en lumière les connaissances actuelles et les domaines nécessitant davantage de recherches.

PHYSIOLOGIE DE LA REPRODUCTION ET MIGRATION DES SPERMATOZOÏDES

Dans les troupeaux de chevaux à l’état sauvage, l’étalon d’un harem vit avec un groupe de juments généralement composé de moins de 10 femelles, parfois jusqu’à 20. Lors de l’œstrus, chaque jument est saillie en moyenne six fois. Lors d’une saillie naturelle, plusieurs milliards de spermatozoïdes sont déposés dans l’utérus, tandis que lors d’une insémination artificielle, ils ne sont que quelques centaines de millions, généralement entre 200 et 400 millions [¹¹]. En moins de 10 minutes, les spermatozoïdes atteignent l’entrée des oviductes, et dans un délai de 1,5 heure, entre 2 000 et 4 000 d’entre eux colonisent la jonction utéro-tubaire de chaque oviducte. Cependant, la quasi-totalité des spermatozoïdes est évacuée de l’utérus par le col en moins de 4 heures. Leur migration rapide vers les trompes est principalement assurée par les contractions utérines, bien plus que par la mobilité des spermatozoïdes eux-mêmes, dont la vitesse moyenne est d’environ 50 µm/s (soit 18 cm/h), la distance entre le col de l’utérus et l’extrémité de l’utérus étant d’une cinquantaine de centimètres. Un tri strict se produit, permettant uniquement aux spermatozoïdes mobiles, bien orientés et sans anomalies morphologiques de pénétrer dans les oviductes. Les spermatozoïdes frais se fixent à l’épithélium tubaire, mais les sites de fixation sont limités et peuvent rapidement être saturés. Une fois fixés, les spermatozoïdes deviennent immobiles, mais peuvent survivre longtemps, jusqu’à 48 heures et parfois jusqu’à une semaine. Cela explique pourquoi, dans les cas de saillie ou d’insémination artificielle en sperme frais, 75 % des conceptions ne proviennent pas de la dernière saillie préovulatoire, mais d’une des précédentes. En effet, la fécondation a lieu dans un délai qui dépasse souvent l’ovulation immédiate. En revanche, après une cryoconservation, cette fixation tubaire ne se produit pas, ce qui limite la durée de survie des spermatozoïdes à environ 24 heures. Même si certaines informations sur la physiologie de la reproduction équine sont bien établies, plusieurs éléments restent incertains. Le mécanisme qui trie les spermatozoïdes à l’entrée de la jonction utéro-tubaire et qui sélectionne ceux aptes à féconder reste totalement inconnu. La question du processus exact de capacitation des spermatozoïdes équins demeure également un sujet de recherche. Bien que l’attachement des spermatozoïdes frais aux cellules épithéliales tubaires semble essentiel, il est difficile de comprendre comment les spermatozoïdes cryoconservés, qui ne se fixent pas à ces cellules, parviennent à se capaciter.

DÉFINITION ET VARIABILITÉ DES DOSES DE SPERME CONGELÉ

Une dose de sperme congelée correspond à la quantité minimale de spermatozoïdes mobiles et progressifs (ou “fléchants”) nécessaire pour obtenir une gestation. Cette quantité est déterminée par le calcul suivant : nombre total de spermatozoïdes progressifs dans une dose = (nombre de paillettes) × (concentration de spermatozoïdes par paillette) × (pourcentage de spermatozoïdes progressifs après décongélation). La variabilité dans la présentation des doses vendues dans le monde peut prêter à confusion. En suivant les recommandations de la World Breeding Federation for Sport Horses (WBFSH), qui préconisent 250 millions de spermatozoïdes progressifs par insémination et un taux de mobilité postdécongélation supérieur à 35 %, un total de 714 millions de spermatozoïdes est obtenu. Le nombre de paillettes nécessaires par dose varie selon leur concentration (^{photo 1}). Historiquement, en France, une dose équivaut à 8 paillettes, avec une concentration de 100 M/ml et un taux supérieur à 35 % de mobilité progressive postdécongélation. Néanmoins, bien qu’il s’agisse de recommandations, aucune obligation ni contrôle de la qualité n’est réalisé. Aux États-Unis, il est vivement conseillé de faire apparaître sur chaque contrat de saillie les mentions suivantes : « Une dose est définie comme une insémination unique avec xx paillettes de xx ml contenant chacune un minimum de xx millions de spermatozoïdes totaux qui, une fois décongelée par la méthode appropriée, résulte en une motilité progressive moyenne minimale postdécongélation de xx %. Le vendeur s’engage à fournir les recommandations de décongélation et de transport pour les doses fournies. » À défaut d’un véritable contrôle de la qualité, cela permet à l’acheteur de savoir réellement ce qu’il achète. Du fait de cette variabilité, il est difficile de pouvoir comparer correctement l’influence de ces doses sur la fertilité. Toutefois, la relation entre la fertilité et la dose de sperme ne semble pas linéaire, mais plutôt sigmoïdale et, pour chaque étalon, la fertilité par cycle ainsi que la quantité de sperme nécessaire varient (^{figure 1}). La corrélation entre la fertilité et les différents paramètres observés (nombre de paillettes, concentration, pourcentage de spermatozoïdes fléchants, etc.) n’est pas simple à évaluer. Barrier-Battut a proposé un modèle prédictif fondé sur des méthodes comme la cytométrie de flux et l’observation microscopique, en prenant en compte 25 variables distinctes [¹]. Des études de terrain, principalement réalisées par les Haras nationaux, ont comparé la fertilité obtenue avec une seule paillette versus la dose classique de 8 paillettes. En réduisant le nombre de paillette de 8 à 1, la fertilité obtenue diminue de plus de 20 points par cycle (45 % versus 25 %). Il est important de bien définir le concept de fertilité : s’agit-il de la fertilité par cycle ou sur une saison ? Par exemple, faut-il inclure les cycles mal suivis, où l’IA est réalisée au mauvais moment ? Ces nuances sont importantes afin de ne pas arriver à des conclusions hâtives. De même, la notion de subfertilité varie : il est commun d’affirmer qu’une jument est subfertile après 3 cycles infructueux, mais ce seuil est-il toujours pertinent ? Avec une fertilité par cycle de 60 % (valeurs attendues en monte naturelle ou en IA en sperme frais), 94 % des juments seront gestantes après 3 cycles, au lieu de 83 % pour une insémination artificielle en semence congelée (IAC) à 8 paillettes et 58 % pour une IAC à 1 paillette (^{figure 2}). Pour obtenir 93 % de gestations, il faut 5 cycles pour une IAC à 8 paillettes et 10 cycles pour une IAC à 1 paillette. Ces chiffres sont purement théoriques : un suivi de chaleurs optimal et une gestion rigoureuse des endométrites persistantes post-IA permettent de les augmenter. Néanmoins, ces données soulignent que l’échec ne peut pas simplement être attribué à la jument ou à la qualité de l’étalon, mais parfois seulement au nombre de paillettes et a fortiori au choix de la paillette. En effet, Barrier-Battut a montré que la mobilité des spermatozoïdes peut varier de 19 à 63 % dans 6 paillettes issues d’un même éjaculat [¹]. Cela démontre que plus il y a de paillettes utilisées, plus cette hétérogénéité est compensée, tandis que l’emploi d’une seule est plus aléatoire. Cependant, toutes les doses fabriquées dans le monde suivent les mêmes recommandations en théorie, il est donc “acceptable” d’attendre environ 45 % de taux de fertilité par cycle par étalon. Néanmoins, la sélection génétique dans l’industrie équine s’est davantage orientée vers les performances sportives que reproductives, ou la congélabilité de la semence [²⁰]. La variabilité se manifeste non seulement entre les étalons, mais aussi entre les éjaculats d’un même étalon [⁸]. Lorsqu’il est possible de conserver et de commercialiser la majeure partie des paillettes (plus de 3 éjaculats sur 5 environ), le sperme est dit good freezer, par opposition au bad freezer, c’est-à-dire à celui qui ne se congèle pas bien. Environ 30 % des étalons produisent du sperme de haute qualité postdécongélation, tandis que 40 % affichent des résultats « acceptables » et que 30 % ont un sperme considéré comme subfertile [⁹]. Cela signifie qu’environ 70 % des étalons produisent un sperme qui peut conduire à des gestations après la congélation.

PROTOCOLE DE CONGÉLATION ET SÉLECTION DES SPERMATOZOÏDES

Depuis des années, différents dilueurs et protocoles de congélation sont testés afin de trouver celui qui convient le mieux à chaque étalon. De plus, de nouveaux procédés expérimentaux tentent de prédire la congélabilité des éjaculats : c’est le cas notamment de celui qui utilise le précurseur de la protéine d’ancrage de l’A-kinase (AKAP4) [⁴]. Même s’il est difficile de prédire quel procédé conviendra le mieux à tel étalon, dans la majorité des cas un protocole standard permet d’obtenir de la semence congelée exploitable.

Sélection des spermatozoïdes

Ainsi, la centrifugation est appliquée à quasiment tous les éjaculats afin de retirer un maximum de liquide séminal. Il est établi que ce liquide module la réponse inflammatoire utérine, protège les spermatozoïdes contre l’inflammation endométriale, stimule la contractilité utérine et régule les sécrétions utérines et tubaires. Cependant, il reste à comprendre de manière précise le rôle des vésicules extracellulaires comme transporteurs des signaux chimiques entre les différentes cellules, et si ces effets varient selon l’étalon ou même d’un éjaculat à l’autre. La centrifugation est une étape cruciale pour éliminer les impuretés du sperme, comme les cellules mortes et les résidus de plasma, et pour concentrer les spermatozoïdes. Une centrifugation douce contribue à préserver la viabilité des spermatozoïdes tout en réduisant le volume de l’échantillon, ce qui peut améliorer les taux de fertilité. En revanche, une centrifugation trop agressive peut endommager les spermatozoïdes et diminuer les chances de conception après la décongélation. Il existe plusieurs méthodes de sélection des spermatozoïdes, chacune ayant ses avantages et ses inconvénients [¹⁷] :

– la centrifugation standard consiste à centrifuger à 600 G pendant 10 minutes, avec le risque d’entraîner des pertes de spermatozoïdes dans le surnageant et de provoquer des dommages mécaniques. La force centrifuge peut être augmentée à 1 800 G ou 2 400 G pendant 5 minutes, ce qui permet de réduire les pertes sans compromettre la qualité du sperme ;

– la centrifugation sur coussin utilise un coussin de centrifugation (comme MaxiFreeze ou Red Cushion) qui permet de minimiser les pertes de spermatozoïdes et d’améliorer leur récupération. Cette méthode nécessite une centrifugation à 1 000 G pendant 20 minutes ;

– la sélection par gradient de densité consiste à utiliser un colloïde (par exemple, EquiPure® ou AndroColl® Equine) pour séparer les spermatozoïdes mobiles et sains du plasma et des débris (^{photos 2a} à ^2c). La centrifugation à 300 G pendant 20 à 30 minutes permet de conserver les spermatozoïdes les plus aptes à la fertilisation, tout en éliminant ceux de qualité inférieure ;

– la filtration, à l’aide de filtres comme le SpermFilter®, permet de concentrer les spermatozoïdes sans recourir à la centrifugation. Cette méthode est rapide (5 à 10 minutes) et efficace, mais elle est aussi coûteuse.

En reproduction humaine, la sélection après congélation, donc avant l’insémination, reste controversée : elle pourrait d’une part améliorer les taux de fertilité et la qualité du sperme utilisé, mais est d’autre part associée à une augmentation des dommages subis par les spermatozoïdes. Son application chez le cheval nécessite des études complémentaires.

Dilueurs et concentration

La cryoconservation des spermatozoïdes est une étape fondamentale dans les techniques de reproduction assistée. Des protocoles optimisés de congélation et de décongélation sont nécessaires pour garantir la viabilité du sperme. La composition des milieux de dilution ainsi que la concentration des spermatozoïdes jouent un rôle crucial dans cette viabilité. Les dilueurs sont généralement composés de lait ou de protéines micellaires de lait, de jaune d’œuf et de glycérol qui reste l’agent cryoprotecteur de référence. La concentration idéale de glycérol, qui varie selon les études, est classiquement de 3,5 % [²¹]. Une augmentation de la concentration accroît la mobilité postdécongélation mais tend à réduire la fertilité, en raison d’un effet toxique à de fortes concentrations. Il convient donc de faire figurer cette concentration sur les documents d’expédition des paillettes pour plus de transparence. L’impact de la concentration en spermatozoïdes sur la qualité du sperme congelé a fait l’objet de nombreuses études. Une concentration trop élevée de spermatozoïdes peut nuire à leur viabilité après la décongélation en raison d’un apport insuffisant en cryoprotecteur. De même, une forte concentration peut entraîner une réaction inflammatoire utérine plus marquée. À l’inverse, une concentration trop faible est responsable d’une réduction de l’efficacité de l’insémination artificielle, avec moins de spermatozoïdes viables pour la fécondation. La concentration de 100 × 10⁶ spermatozoïdes par millilitre, actuellement recommandée en France, semble être la plus adaptée pour maximiser la qualité et la fertilité des spermatozoïdes congelés [¹⁴].

Décongélation

La structure qui a procédé à la congélation est la mieux placée pour déterminer la technique de décongélation et le protocole d’insémination les plus adaptés au sperme de l’étalon concerné. En règle générale, les paillettes de 0,5 ml sont décongelées en les immergeant dans un bain-marie à 37 °C pendant plus de 30 secondes. Toutefois, certains laboratoires recommandent de décongeler les paillettes de 0,5 ml dans un bain-marie à 75 °C pendant 7 secondes exactement. Le temps de cette procédure est critique : une exposition des paillettes à des températures extrêmes dépassant de 1 ou 2 secondes les préconisations peut entraîner des dommages irréversibles aux spermatozoïdes. Une fois la semence décongelée, il est impératif d’inséminer la jument immédiatement (^{photo 3}).

Évaluation des spermatozoïdes

L’évaluation de la motilité des spermatozoïdes sur le terrain après l’insémination, réalisée à partir d’une goutte récupérée sur une paillette, se fait principalement à l’aide d’un microscope à plateau chauffant à 37 °C. Cependant, cette méthode peut être sujette à des biais humains. Pour limiter ces biais, des analyseurs assistés par ordinateur (computer-assisted semen analysis, CASA) ont été développés. Ces systèmes permettent une mesure précise des paramètres tels que la vitesse de déplacement et la motilité progressive. Les échantillons doivent être dilués avec un diluant commercial afin de limiter l’impact de la concentration sur l’évaluation de la motilité. Toutefois, les types de cupules d’analyse peuvent influencer les résultats, et il n’existe pas encore de standardisation des valeurs seuils. La classification d’un spermatozoïde comme fléchant dépend des critères de réglage des analyseurs, qui diffèrent beaucoup entre les publications, les équipes de recherche et a fortiori les centres de congélation (^tableau). Une étude récente réalisée chez les taureaux a permis de standardiser certaines valeurs, afin de mieux contrôler la qualité des analyses [¹⁶]. Avec des seuils classifiés comme « faibles », environ 70 % des spermatozoïdes ont été classés comme progressifs. En revanche, avec des seuils « élevés », presque tous les spermatozoïdes ont été reclassés parmi les cellules mobiles totales, n’en laissant que 11 % considérés comme progressifs [¹⁶]. Les réglages standardisés appliqués aux analyseurs IVOS II dans les différents centres ont montré une variabilité de 2 % pour les spermatozoïdes mobiles et de 21 % pour les spermatozoïdes fléchants. Cependant, aucune variation n’a été observée lorsque ces réglages standardisés ont été appliqués uniformément sur toutes les machines [¹⁶]. Il est donc évident que le manque de standardisation entre les centres de congélation et les différents pays complique les comparaisons. Par exemple, un éjaculat considéré comme non congelable selon les exigences des Haras nationaux pourrait être commercialisé ailleurs. Ainsi, il n’existe aucune garantie que la qualité des doses utilisées respecte les recommandations de la WBFSH.

LIEU DE DÉPÔT DU SPERME ET INTERVALLE D’EXAMEN

Un autre facteur susceptible d’influencer la réussite de l’insémination en sperme congelé est le site de dépôt du sperme. Une étude comparative rapporte que l’utilisation de 14 × 10⁶ spermatozoïdes mobiles postdécongélation conduit à des taux de gestation similaires, qu’ils soient déposés dans le corps utérin ou à la jonction utéro-tubaire [¹⁶]. Cependant, pour des quantités de 3 × 10⁶ spermatozoïdes mobiles, l’insémination hystéroscopique affiche un taux de gestation supérieur (47 %) par rapport à une insémination dans le corps utérin (15 %) [¹³]. En pratique, si les critères de commercialisation sont respectés, une paillette française contient a minima 17,5 × 10⁶ spermatozoïdes fléchants. Ainsi, l’insémination en haut de corne n’apporterait pas d’avantage significatif avec une telle concentration. La durée de survie et l’aptitude des spermatozoïdes à féconder dans les trompes utérines après l’éjaculation sont encore mal comprises. De même, la durée du transit des spermatozoïdes capacités dans les oviductes reste floue, tout comme le délai exact entre la saillie ou l’insémination et la fécondation, qui dépend probablement de l’animal, de l’éjaculat et du cycle de la jument. En ce qui concerne l’ovocyte, sa durée de vie après l’ovulation et son aptitude à être fécondé varient probablement d’un animal à l’autre. Néanmoins, il conserve son potentiel fécondant pendant environ 12 heures après l’ovulation. Historiquement, un suivi intensif des juments toutes les 4 heures, voire moins, était la norme. La réduction du nombre de paillettes disponibles incite à envisager un retour à ce modèle. Néanmoins, les études menées sur le sujet nuancent cette approche. Par exemple, Newcombe a montré qu’il n’y a pas de différence significative entre les taux de gestation suivant l’intervalle d’examen, que celui-ci soit de 0 à 3 heures, de 3 à 6 heures, de 6 à 9 heures, de 9 à 12 heures ou même de 12 à 15 heures [¹⁵]. Plus récemment, Immonen a observé l’influence de l’intervalle entre les examens dans le cadre de l’insémination à la paillette [⁶]. Ses résultats ne révèlent pas de différence significative des taux de gestation à 14 jours ou à 45 jours entre des suivis effectués toutes les 4 heures, 8 heures ou 16 heures, avec des taux de gestation avoisinant 35 % [⁶].

VERS DE NOUVELLES TECHNOLOGIES

Des techniques de sélection peuvent être mises en place afin d’améliorer la qualité des doses de sperme. Elles sont les mêmes que pour la concentration précongélation et reposent majoritairement sur la centrifugation. Récemment, une chambre microfluidique déjà utilisée en reproduction humaine a montré des résultats prometteurs pour la fécondation in vitro chez le cheval [¹⁸]. Cela pourrait éventuellement s’étendre à un tri des doses congelées au moment de la décongélation, comme le souligne cette étude récente, avec des taux de collecte d’embryons satisfaisants, et en ayant de plus réduit la fréquence des examens des juments à une fois par jour [¹²].

CONCLUSION

Il est difficile de connaître la qualité des doses utilisées. Malgré la multitude de procédés qu’il est possible de mettre en place, tels que le suivi rapproché ou la centrifugation postdécongélation, les praticiens restent tributaires de la qualité de la semence reçue. Prendre du recul permet à la fois de relativiser l’importance d’être strictement présent au moment précis de l’ovulation et de ne pas surinvestir dans des suivis à l’heure près. Cela rappelle également qu’un échec après deux cycles d’insémination n’est pas forcément inquiétant.

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