Le biofilm en médecine vétérinaire équine - Pratique Vétérinaire Equine n° 208 du 01/10/2020
Pratique Vétérinaire Equine n° 208 du 01/10/2020

Bactériologie

Dossier

Lutte contre l’antibiorésistance

Auteur(s) : Albertine Léon*, Marine Pottier**, Sophie Castagnet***, Pierre-Hugues Pitel****

Fonctions :
*Labéo
1, route de Rosel
14280 Saint-Contest
**Université de Caen-Normandie (UniCaen),
U2RM
1, esplanade de la Paix
14000 Caen
***Labéo
1, route de Rosel
14280 Saint-Contest
****Université de Caen-Normandie (UniCaen),
U2RM
1, esplanade de la Paix
14000 Caen
*****UniCaen, GRAM 2.0
2, rue des Rochambelles
14000 Caen
******Labéo
1, route de Rosel
14280 Saint-Contest
*******Labéo
1, route de Rosel
14280 Saint-Contest

Structure complexe et fascinante, en constante mutation, le biofilm protège les bactéries qui le constituent. Les stratégies qui ciblent les différentes étapes de sa formation sont en plein essor.

Les bactéries existent sous deux formes, soit libre en suspension (forme planctonique), soit sessile en agrégats (biofilm) [6, 21]. Le biofilm, principal moyen de persistance des bactéries, est décrit comme une communauté de micro-organismes qui s’agrègent grâce à la production d’une matrice polymérique et adhèrent à des surfaces inertes ou biologiques très diverses (minérales, végétales, animales, industrielles ou médicales) [8, 21, 24]. Il est estimé qu’environ 80 % de la biomasse mondiale se présente sous la forme de biofilms [22]. Dans l’environnement, ces derniers peuvent se former aux différentes interfaces air/liquide, liquide/liquide et solide/ liquide [26]. Cette structure complexe devient, au cours de sa maturation, particulièrement tolérante à toutes sortes de stress tels que la dessiccation, la carence en nutriments, l’exposition aux acides, aux agents antibactériens et aux désinfectants, etc. (figure 1 et encadré 1) [25, 27]. Les biofilms peuvent alors induire des infections cliniques, directes et indirectes, plus importantes et moins faciles à soigner que celles provoquées par les bactéries sous leur forme libre [31].

Caractéristiques du biofilm bactérien

Le biofilm bactérien est une structure tridimensionnelle et dynamique en constant changement. Il peut être constitué d’une seule population bactérienne (mono-espèce) ou de populations diverses (pluri-espèces). Le biofilm est considéré comme un milieu hétérogène structuré de par ses gradients physico-chimiques, son hétérogénéité métabolique et sa répartition cellulaire. Les biofilms se forment sur de multiples surfaces et sont d’une épaisseur variable selon les conditions environnementales et les espèces qui les composent (encadré 2, figures 2 et 3). Cependant, ils présentent tous une organisation spatiale stratifiée, ce qui permet notamment une coopération entre les micro-organismes qui les constituent via des échanges d’informations et de nutriments.

Malgré leur diversité, les différents biofilms et leurs populations bactériennes partagent des caractéristiques communes [8, 24, 30].

Les populations bactériennes du biofilm autoproduisent une matrice extracellulaire polymérique fortement hydratée (plus de 90 % d’eau) composée d’exopolysaccharides, de protéines, de lipides et d’acides nucléiques dont la répartition dépend de l’espèce bactérienne concernée [28]. Elles répondent à des signaux extracellulaires qui sont soit présents dans l’environnement proche de la bactérie, soit produits par la bactérie même. C’est le cas du quorum sensing (QS) qui est un mécanisme de régulation de l’expression génique, en réponse à des variations de la densité cellulaire, permettant aux micro-organismes de synchroniser leur comportement [19, 20]. Ce mécanisme implique la production, la sécrétion et la détection par les bactéries de molécules signal nommées auto-inducteurs. Dès que la concentration en ces molécules atteint une valeur seuil, des régulateurs transcriptionnels vont être activés et exercer un contrôle sur des gènes spécifiques, notamment impliqués dans la virulence, ainsi que dans la phase de formation et de dispersion du biofilm [19]. Le QS régule également la physiologie et l’épaisseur du biofilm.

Ces bactéries sont davantage sujettes aux transferts horizontaux d’information génétique par conjugaison (comme les gènes de résistance aux antibiotiques) puisqu’au sein du biofilm, le contact entre elles est largement favorisé [11]. Elles sont protégées des agressions extérieures telles que le système immunitaire de l’hôte, la dessiccation ou encore les biocides (antibiotiques et désinfectants), notamment via une expression différentielle des gènes, par comparaison avec leur forme libre. En effet, les biofilms tolèrent les antibiotiques à des concentrations 10 à 1 000 fois plus importantes que les bactéries planctoniques [1, 15].

Les difficultés induites par le biofilm en médecine vétérinaire

Impact direct

L’implication directe des biofilms est décrite dans de nombreux processus infectieux chez l’homme. Ils sont notamment responsables de diverses infections digestives, respiratoires et urogénitales [24]. En médecine vétérinaire, le biofilm de nombreuses bactéries pathogènes a également déjà été exploré (encadré 3) [6, 14, 30]. En médecine équine, l’impact du biofilm a été étudié lors d’infections utérines, plus spécifiquement en cas d’endométrite à Pseudomonas aeruginosa et d’infection impliquant Streptococcus equi subsp. zooepidemicus [5, 9, 17, 33]. Les biofilms survenus à la suite de la suture d’une plaie chirurgicale ont aussi fait l’objet de plusieurs études [7, 13, 16, 32]. Ils impliquent différentes espèces bactériennes telles que Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus epidermidis, Serratia marcescens, Enterococcus faecium ou Enterococcus faecalis. En outre, en 2019 des travaux menés in vitro ont porté sur la capacité de plusieurs souches de Rhodococcus equi à produire du biofilm [3].

Les biofilms sont particulièrement impliqués dans la chronicité des infections. En effet, en raison d’une faible concentration en éléments nutritifs, ainsi qu’en oxygène, une part des cellules bactériennes situées en profondeur du biofilm sont peu actives, voire dormantes (moins de 1 % de la population originale) [22, 24]. Elles ne sont donc pas ciblées par les antibiotiques qui inhibent le processus métabolique bactérien. Ces cellules dormantes, dites persistantes, ne sont pas devenues résistantes mais tolérantes, il est alors possible de parler d’infections tolérantes aux médicaments.

C’est seulement une fois la concentration en antibiotiques diminuée que ces cellules vont permettre la repopulation du biofilm affaibli par le traitement antibiotique et conduire à une chronicité de l’infection [4, 18].

Impact indirect

L’impact indirect des biofilms sur la transmission d’agents pathogènes reste largement sousestimé. En effet, l’environnement de la clinique vétérinaire peut représenter un réservoir idéal pour les micro-organismes (comme l’hôpital et les infections nosocomiales pour l’homme). Le biofilm s’intègre dans un cycle de contamination qui inclut l’animal, les bactéries et des vecteurs tels que l’air, l’eau, les surfaces, l’équipe de soins ou encore les dispositifs médicaux.

En contact avec le biofilm, l’eau agit comme un vecteur important pour le transport et la transmission des bactéries. Ainsi, le réseau d’eau (distribution et assainissement) d’une clinique, tout comme celui d’un hôpital, peut être impacté, avec l’implication d’espèces telles que Pseudomonas spp. et Legionella spp. Les biofilms sont également présents sur des surfaces internes (dents, prothèse, etc.) ou externes (table de chirurgie, paillasse, etc.), impliquant dans ce cas notamment les espèces bactériennes Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (Sarm), Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanii et les entérobactéries. Enfin, les biofilms peuvent aussi s’ancrer sur des dispositifs médicaux (endoscopes, cathéters, etc.) et ne seront pas totalement éliminés par les protocoles de nettoyage et de désinfection même scrupuleux. Ils deviennent alors des vecteurs de dissémination de micro-organismes potentiellement pathogènes.

Principales approches permettant de lutter contre le biofilm

La résistance, ou la tolérance, conférée aux bactéries du biofilm est responsable de l’échec des traitements antibiotiques, ce qui a incité au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, en association ou non avec le traitement antibiotique initial. Bien que beaucoup moins documenté pour la médecine vétérinaire, un éventail de stratégies thérapeutiques, curatives ou préventives, est aujourd’hui proposé en médecine humaine. Elles ciblent les différentes étapes de la formation du biofilm (figure 4). Dernièrement, des améliorations significatives ont été réalisées au niveau de la pénétration des molécules biocides au cœur des biofilms, par exemple via leur encapsulation dans des nanoparticules [25]. Cela conduit à un effet synergique de plusieurs principes actifs ayant des propriétés antibiofilms et/ou antibactériennes. D’autres stratégies, envisagées pour prévenir ou inhiber le développement du biofilm, visent à prévenir l’adhésion initiale du micro-organisme ou la croissance microbienne, à empêcher la communication entre les cellules bactériennes, à inhiber la synthèse de la matrice d’exopolysaccharides ou à la dégrader grâce à des enzymes pour induire la dispersion du biofilm. Dans ce dernier cas, la stratégie doit être associée à l’administration d’antibiotiques, car les cellules libérées, qui n’ont pas acquis de mécanisme de résistance, retrouvent leur sensibilité initiale à ces molécules [14, 25, 30]. Pour le cas particulier des cellules persistantes, il pourrait être intéressant de coupler un antibiotique avec une molécule essentielle à ce type de cellule [18].

Une nouvelle solution alternative thérapeutique, fondée sur la stratégie du quorum quenching, consiste à développer des perturbateurs des signaux intracellulaires et extracellulaires, notamment des inhibiteurs du QS [12, 20]. Ces derniers vont agir soit en inhibant la génération des signaux, soit en bloquant le récepteur du signal, soit en perturbant le signal émis, altérant ainsi les interactions intercellulaires nécessaires à la formation du biofilm.

Des composés d’origine naturelle, comme les huiles essentielles de menthe poivrée (Mentha piperita), de clou de girofle (Syzygium aromaticum), de thym vulgaire à thymol (Thymus vulgaris CT thymol) ou d’arbre à thé (Melaleuca alternifolia), sont également décrits comme possédant des propriétés antibiofilms [23, 25]. L’immunothérapie, la phagothérapie, la thérapie photodynamique et les technologies d’édition de gènes appelées CRISPR sont depuis peu envisagées [25, 29].

En médecine vétérinaire équine, dans un contexte clinique d’endométrite chronique chez la jument, l’effet antibiofilm de molécules telles que la N-acétylcystéine, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et le peroxyde d’hydrogène a été évalué sur les biofilms produits par des bactéries comme Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. La réduction de la biomasse du biofilm observée est dépendante de la concentration des molécules utilisées et des espèces bactériennes impliquées [10, 17]. Des études complémentaires sont nécessaires pour aboutir à des recommandations applicables sur le terrain.

Conclusion

Le mode de vie des bactéries sous la forme de biofilms est encore méconnu en médecine vétérinaire équine. De fait, ses impacts à la fois directs et indirects sont certainement sous-estimés. Ainsi, les actuels standards de désinfection pourraient se révéler insuffisants pour éliminer complètement les biofilms, induisant l’accumulation d’une biomasse bactérienne résistante à de multiples facteurs environnementaux. Le praticien devra, à terme, prendre en compte le biofilm dans sa démarche de soins. De plus, les nouvelles stratégies thérapeutiques envisagées en médecine humaine devraient être, in fine, transposables en médecine vétérinaire.

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CONFLIT D’INTÉRÊTS : AUCUN

Éléments à retenir

→ Le biofilm, mode de vie prédominant des bactéries dans des conditions naturelles, peut se développer sur une surface biotique comme abiotique.

→ Le biofilm est une structure complexe stratifiée où les bactéries sont plus résistantes que sous leur forme libre.

→ Qualifiés de réservoirs d’infections, les biofilms sont particulièrement impliqués dans la chronicité des processus infectieux.

→ Des stratégies thérapeutiques ciblant les différentes étapes de la formation du biofilm sont en cours de développement.

ENCADRÉ 1 : PROCESSUS DE DÉVELOPPEMENT D’UN BIOFILM BACTÉRIEN

La croissance d’un biofilm est un processus cyclique qui comporte quatre étapes clés.

1. Adhésion

Les bactéries libres vont venir s’agréger à un support, soit par un phénomène d’adsorption guidé par des propriétés d’hydrophobicité (implication des molécules d’adhésion), soit par un phénomène de transport actif (intervention de structures spécifiques de la bactérie comme leur flagelle). Cette adhésion est d’abord réversible et implique des liaisons électrostatiques faibles. Par la suite, elle peut devenir irréversible, grâce à des interactions fortes et spécifiques, si le temps de contact entre le support et la bactérie est suffisant.

2. Multiplication et construction

Dès que les conditions environnementales le permettent (température, humidité, éléments nutritifs, etc.), les bactéries vont se multiplier jusqu’à former des microcolonies. Lors de cette étape, elles vont synthétiser une matrice d’exopolysaccharides. Cette dernière est constituée de polysaccharides, de protéines, d’ADN et de lipides. Elle permet d’assurer la cohésion entre les bactéries et de les protéger contre les différents stress de l’environnement extérieur (antibiotiques, désinfectants, etc.). La matrice va également limiter la diffusion des nutriments, des déchets métaboliques, ainsi que la circulation des gaz comme l’oxygène au sein du biofilm.

3. Maturation

Elle débute lorsque les microcolonies atteignent une quantité de biomasse suffisante pour induire une hétérogénéité importante, caractérisée par la formation de différents microenvironnements au sein du biofilm. La plupart des bactéries réagissent à ces conditions changeantes en adaptant leur métabolisme (par exemple, passage de la respiration à la fermentation lors d’une limitation en oxygène). C’est dans ces conditions hétérogènes que se développent les bactéries dites “persistantes”, qui affichent une tolérance très élevée aux désinfectants et aux antibiotiques.

4. Dispersion

Il s’agit de l’étape finale de la formation du biofilm. Une fois ce dernier mature, les micro-organismes qui le composent vont être relâchés et disséminés vers l’environnement extérieur. Le détachement des cellules peut être initié par différents facteurs : des perturbations mécaniques, une dégradation enzymatique de la matrice d’exopolysaccharides et/ou du substrat sur lequel le biofilm est attaché, l’induction de la motilité ou encore la production d’agents tensioactifs. Les bactéries ainsi libérées vont alors coloniser une nouvelle surface, favorable à un nouveau cycle de vie, sous la forme d’un biofilm. Le détachement et la dispersion de cellules bactériennes d’un biofilm jouent un rôle important dans la transmission de bactéries des réservoirs environnementaux jusqu’à l’hôte (animal ou homme), entre ces derniers, et dans la propagation de l’infection chez un hôte.

D’après [6, 8, 21, 24].

ENCADRÉ 2 : MÉTHODES D’ÉTUDE DU BIOFILM

→ Deux types de méthodologie existent pour étudier les étapes de formation du biofilm et évaluer le potentiel effet antibiofilm de molécules thérapeutiques : il s’agit des méthodes d’étude en conditions statique et dynamique [2, 24, 30].

→ Historiquement, la quantification de la biomasse du biofilm en condition statique a été et est réalisée par sa coloration au cristal violet, suivi de son dosage. Par cette méthode, la pellicule (le biofilm) formée aux interfaces solide/liquide et air/liquide peut être quantifiée. Pour cette technique, des cultures bactériennes sont réalisées en milieu liquide (tube) et placées à l’incubation dans des conditions espèces dépendantes. Le biofilm formé peut ensuite être visualisé après sa coloration, puis solubilisé. Enfin, une lecture d’absorbance permet la quantification de la biomasse du biofilm formé. Par la suite, pour permettre un criblage haut débit, la méthode a été adaptée en microplaques de 96 puits. Cette technique, couplée à l’analyse de mutants, a permis d’identifier de nombreux gènes impliqués dans la formation du biofilm.

→ Plus récemment, la technologie xCELLigence (alliant la microélectronique et la biologie cellulaire), fondée sur la mesure d’impédance, a été introduite parmi les méthodes d’étude du biofilm. L’xCELLigence permet de quantifier les variations de flux électronique au niveau de l’interface solide/liquide sous la forme d’une valeur sans dimension, l’index cellulaire. Ce dernier est représentatif de la densité cellulaire propre à chaque puits, des caractéristiques morphologiques des cellules, ainsi que de leurs capacités d’adhésion et de prolifération.

→ Au niveau de l’étude du biofilm en dynamique, l’utilisation de chambres en flux (flow-cell) couplée à la microscopie permet le suivi d’une culture continue de bactéries soumises à un flux (photo 1). Cette technologie vise ainsi à recréer un biofilm dans des conditions physiologiques et physiopathologiques d’écoulement. Diverses applications existent et permettent notamment l’identification et l’étude des différents facteurs moléculaires impliqués dans la maturation et la structuration du biofilm, ainsi que le screening de molécules antimicrobiennes.

→ Enfin, le développement de la structure tridimensionnelle du biofilm peut être observé par microscopie (confocale laser, inversée, etc.) via l’utilisation de marqueurs fluorescents (photo 2).

ENCADRÉ 3 : BACTÉRIES PATHOGÈNES POUR LES ANIMAUX AU BIOFILM DÉJÀ ÉTUDIÉ

– Actinobacillus pleuropneumoniae

– Aeromonas hydrophila

– Arcanobacterium pyogenes

– Groupe Bacillus cereus

– Bartonella henselae

– Bordetella bronchiseptica et B. parapertussis

– Brucella melitensis

– Burkholderia pseudomallei

– Campylobacter coli et C. jejuni

– Clostridium perfringens

– Corynebacterium pseudotuberculosis et C. renale

– Enterococcus faecalis et E. faecium

– Erysipelothrix rhusopathiae

– Escherichia coli

– Francisella novicida et F. tularensis

– Haemophilus parasuis

– Histophilus somni

– Leptospira

– Listeria monocytogenes

– Mannheimia haemolytica

– Mycobacterium

– Mycoplasma

– Pasteurella multocida

– Pseudomonas aeruginosa

– Riemerella anatipestifer

– Salmonella enterica sérotype typhimurium

– Staphylococcus aureus

– Streptococcus equi

– Yersinia pestis

D’après [14].

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