Collecte in vivo d’ovocytes d’ânesses et chronologie de la maturation in vitro

La plupart des équidés sauvages et plusieurs races d’ânes domestiques sont actuellement menacés ou en voie d’extinction (encadré). Afin de préserver les races asines en danger, une cryobanque de gènes est en cours de création. Elle nécessite la cryoconser­vation du sperme, des ovocytes et/ou des embryons. La cryoconservation des embryons permet de préserver à la fois la génétique des femelles et celle des mâles. C’est la méthode la plus rapide pour restaurer une race [¹³].

La production d’embryons asins in vivo après une monte naturelle ou une insémination artificielle est relativement simple, avec des taux de collecte des embryons de 50 à 76 % [⁶, ²⁴]. Toutefois, chez les équidés, cette production est limitée, car les traitements d’induction d’ovulations multiples sont peu efficaces [²², ²⁸]. De plus, aucun traitement de superovulation efficace n’est disponible pour les ânesses. La production d’embryons in vitro après la collecte de plusieurs ovocytes in vivo permettrait d’obtenir de nombreux embryons par cycle [¹⁸]. C’est donc une technique intéressante pour la conservation du patrimoine génétique. La production d’embryons in vitro requiert quatre étapes. La première est la collecte d’ovocytes chez une femelle donneuse par ponction folliculaire. Cette méthode est largement utilisée chez la jument, mais elle n’a jamais été décrite chez l’ânesse [⁹, ¹¹, ¹², ¹⁴, ¹⁸-²⁰, ²⁵]. La deuxième étape est la maturation in vitro des ovocytes. Seulement deux articles rapportent la maturation d’ovocytes asins collectés chez des femelles après abattage, en Égypte et en Chine, et la durée optimale de maturation n’a pas été évaluée [¹, ³⁰]. La troisième et la quatrième étape sont respectivement la fécondation in vitro (FIV) des ovocytes et la culture in vitro des embryons jusqu’à un stade permettant la cryoconservation ou le transfert dans une femelle receveuse. Aucune technique concernant ces deux étapes n’a été mise au point dans l’espèce asine.

L’objectif de cette étude a donc été le développement de techniques de collecte d’ovocytes d’ânesses in vivo et de maturation de ces ovocytes in vitro.

Matériel et méthode

Collecte des ovocytes d’ânesses

Pendant la saison de reproduction, l’activité ovarienne de 9 ânesses adultes cycliques de notre troupeau expérimental a été suivie par échographie transrectale (^{photo 1}). Les femelles ayant plusieurs follicules en croissance de 5 à 25 mm et pas de corps jaune ont été choisies, nos travaux antérieurs sur l’espèce équine ayant montré que ces conditions permettent les meilleurs rendements. Les ovocytes entourés de cellules du cumulus, appelés complexes ovocyte-cumulus (COC), ont été collectés par ponction folliculaire transvaginale sous contrôle échographique. Cette procédure a été réalisée avec une aiguille double voie⁽¹⁾ et une sonde sectorielle⁽²⁾ [¹⁴]. L’ovaire était maintenu par voie transrectale par un premier opérateur qui tenait aussi la sonde dans le vagin de l’animal et positionnait l’ovaire en face de celle-ci, de façon à visualiser les follicules sur l’écran de l’échographe. Un deuxième opérateur introduisait l’aiguille à travers la paroi du vagin dans le follicule sélectionné et déclenchait l’aspiration avec une pression de 0,4 bar. Après aspiration du liquide, les follicules ont été rincés cinq à dix fois avec une solution de phosphate buffered saline (PBS)⁽³⁾ additionnée d’héparine⁽⁴⁾ à 38 °C et la paroi folliculaire a été grattée par rotation de l’aiguille. Tous les fluides obtenus ont été examinés sur une platine chauffante sous loupe binoculaire pour récupérer les COC. Les ovocytes dépourvus de cumulus ou dégénérés n’ont pas été utilisés.

Avant la ponction folliculaire, les ânesses ont reçu une injection de détomidine (Medesedan®, 0,25 ml/animal par voie intraveineuse [IV])⁽⁵⁾ et de butorphanol (Dolorex®, 0,6 ml/animal IV)⁽⁶⁾ pour un effet sédatif et analgésique, puis une injection de dipyrone et de butylscopolamine (Estocelan®, 30 ml/animal IV)⁽⁷⁾ pour un effet analgésique et antispasmodique. Après la ponction, une administration préventive d’antibiotiques (Depocilline®, 20 ml/animal par voie intramusculaire [IM])⁽⁸⁾ a été réalisée.

Maturation in vitro des ovocytes d’ânesses

Les COC ont été lavés dans le milieu de maturation composé de Medium 199 avec des sels de Earle⁽⁹⁾ additionné de 20 % (volume/volume) de sérum de veau fœtal⁽⁹⁾ et de 50 ng/ml de facteur de croissance épidermique (epidermal growth factor, ou EGF)⁽⁹⁾ [¹⁶]. Ils ont ensuite été placés par groupes de 10 à 30 dans 500 µl de milieu de maturation dans un incubateur avec 5 % de CO2 dans l’air et 100 % d’humidité à 38,5 °C pendant 24, 30, 34 ou 38 heures.

Évaluation du stade de maturation nucléaire

Le stade de maturation nucléaire a été analysé après 0, 24, 30, 34 ou 38 heures de maturation in vitro. Les ovocytes ont été séparés facilement des cellules du cumulus par quelques aspirations répétées avec une pipette dans une solution de PBS, fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS pendant 20 minutes à température ambiante, puis lavés dans une solution de PBS. Afin de visualiser l’ADN, ils ont été incubés dans une solution de bis-benzimide (Hoechst 33342®)⁽⁹⁾ à 1 µg/ml dans le PBS pendant 5 minutes, puis montés entre lame et lamelle et observés avec un microscope à fluorescence⁽¹⁰⁾.

Résultats

Taux de collecte des ovocytes d’ânesses

Cinq sessions de ponctions folliculaires avec 3 à 6 ânesses par session ont été réalisées. Au cours de ces cinq sessions, 193 follicules ont été ponctionnés et 92 COC collectés (48 %). Le taux de collecte a augmenté au cours des sessions, de 34 % à la première à 56 % à la cinquième (^{tableau 1}). En moyenne, 4,2 COC par ânesse ont été collectés, avec un maximum de 10 COC par ânesse pour 2 femelles.

Aspect du cumulus au cours de la maturation in vitro

À la collecte, la plupart des ovocytes étaient entourés d’un cumulus compact (88/92, 96 %) (^{photo 2}). Après 24 heures de maturation in vitro, tous les ovocytes étaient entourés d’un cumulus expansé et aucune différence n’a été observée entre les stades de maturation nucléaire (^{photo 3}).

Stade de maturation nucléaire au cours de la maturation in vitro

Les stades de maturation nucléaire des ovocytes d’ânesses à la collecte (0 h) ou après 24, 30, 34 ou 38 heures de maturation in vitro ont été évalués sur une partie des ovocytes prélevés (49/92), l’autre partie étant destinée à une étude différente (^{tableau 2}).

• À la collecte (0 h), 14 ovocytes ont été analysés. Hormis un ovocyte dégénéré, tous étaient immatures, leur ADN étant sous forme de filaments de chromatine (6/14) ou de chromatine partiellement condensée (7/14) (^{photos 4a} et ^4b).

• Après 24 heures de maturation in vitro, 9 ovocytes ont été analysés. La plupart étaient immatures et 2 avaient initié la maturation, la chromatine étant condensée (^{photo 4c}).

• Après 30 heures de maturation in vitro, 9 ovocytes ont été analysés. Quatre étaient encore immatures et 4 avaient atteint le stade de métaphase 1 (^{photo 4d}).

• Après 34 heures de maturation in vitro, 9 ovocytes ont été analysés. Cinq d’entre eux étaient immatures ou en cours de maturation et 4 avaient terminé leur maturation nucléaire puisqu’ils contenaient de l’ADN en métaphase 2 avec un globule polaire (^{photo 4e}).

• Après 38 heures de maturation in vitro, 8 ovocytes ont été analysés. Deux d’entre eux étaient dégénérés et 2 contenaient une métaphase 2 qui commençait à se décondenser, signe d’un début de dégénérescence (^{photo 4f}).

Discussion

Les premiers essais de collecte d’ovocytes in vivo ont été réalisés chez la jument par ponction par le flanc sur jument debout [²³, ²⁹]. Par la suite, la ponction folliculaire transvaginale sous contrôle échographique a été développée chez la jument [⁵, ⁷]. Depuis, elle est utilisée très régulièrement dans le cadre de la recherche en France et au niveau commercial à l’étranger [⁹, ¹¹, ¹², ¹⁴, ¹⁸-²⁰, ²⁵]. Le nombre moyen de follicules ponctionnés par jument et par session varie de 2 à 12 selon l’individu, la race (nombre plus faible chez la ponette par rapport à la jument de selle), le stade du cycle et la saison [¹¹, ¹⁴, ¹⁵, ¹⁹, ²⁵]. Le nombre moyen d’ovocytes équins collectés par jument et par session varie de 0 à 5 et le taux de collecte par follicule chez la jument varie de 20 à 56 % [⁹, ¹¹, ¹⁴, ¹⁵, ¹⁹, ²⁰, ²⁵]. Dans notre étude, le nombre moyen d’ovocytes collectés par ânesse varie de 2,75 à la première session à un maximum de 6 à la quatrième session. Le taux de collecte par follicule chez les ânesses varie de 34 % à la première session à 56 % à la cinquième session. Le personnel qui a réalisé les ponctions folliculaires chez les ânesses effectue régulièrement les mêmes procédures chez les juments, avec des taux de collecte élevés. Il est donc possible que quelques sessions de ponctions sur les ânesses aient été nécessaires pour que les praticiens s’adaptent à celles-ci.

La mise au point de la technique de ponction chez l’ânesse n’a pas montré de différences significatives concernant le rectum et la longueur du ligament ovarien par rapport à la jument. En revanche, le sphincter anal est plus étroit et plus musculeux chez l’ânesse, même comparé à celui de ponettes de taille et de poids équivalents, ce qui augmente la compression sur le bras de l’opérateur. Une longueur inférieure du vagin chez l’ânesse a également été remarquée, ce qui a obligé le praticien à avancer davantage la sonde endovaginale, d’une part, et à exercer une traction plus forte sur le pédicule ovarien, d’autre part. La tension plus importante a entraîné un inconfort majeur chez l’opérateur et chez l’ânesse, et, pour cette dernière, l’analgésie a dû être adaptée. Cependant, des taux de collecte sur ânesses similaires à ceux obtenus sur juments ont été rapidement atteints. Seulement deux articles concernant la maturation in vitro d’ovocytes d’ânesses ont été publiés [¹, ³⁰]. En 2011, Zhao et coll. ont comparé trois milieux de maturation, composés de TCM199 ou de DMEM-F12 additionné de sérum de veau fœtal, d’hormones (folliculo-stimulante [FSH] et lutéinisante [LH]) et de différents additifs (insulin-like growth factor, insuline, transferrine, sélénium, taurine, L-cystéine, L-glutamine, sodium pyruvate, gentamicine). Le pourcentage d’ovocytes qui ont atteint le stade de métaphase 2, après 30 à 36 heures de maturation in vitro, était de 55 % pour les ovocytes avec un cumulus compact et 77 % pour les ovocytes avec un cumulus expansé [³⁰]. En 2014, Abdoon et coll. ont aussi confronté différents milieux (DMEM, DMEM-F12, TCM199, TCM199-F12 et CR1aa) additionnés de sérum de veau fœtal, d’hormones (FSH et human chorionic gonadotropin) et de gentamicine. Le pourcentage d’ovocytes en métaphase 2 variait de 39 à 69 % [¹]. Ces auteurs ont conclu que le milieu TCM199 est un milieu de base efficace pour la maturation des ovocytes d’ânesses. Dans notre étude, la maturation in vitro des ovocytes a été réalisée dans un milieu TCM199 additionné de sérum de veau fœtal et d’EGF, qui a été utilisé pour les ovocytes équins avec des taux de maturation in vitro élevés (61 à 76 %) [³, ⁹, ¹⁰, ¹⁶, ²¹]. Ce milieu a permis, en effet, l’expansion des cellules du cumulus, étape nécessaire de la maturation, puisque tous les ovocytes asins étaient entourés d’un cumulus expansé après 24 heures de maturation in vitro.

En l’absence de données concernant la durée optimale de maturation in vitro pour l’ovocyte d’ânesse, nous avons étudié la chronologie de cette phase entre 0 et 38 heures de culture. À la collecte, les ovocytes d’ânesses contenaient de l’ADN sous forme de filaments de chromatine ou de chromatine partiellement condensée, stade couramment observé pour les ovocytes équins juste après la collecte in vivo [⁴, ¹⁷]. Les premiers ovocytes d’ânesses au stade de métaphase 1 ont été observés après 30 heures de maturation in vitro, alors que les ovocytes équins atteignent ce stade après 24 heures de maturation in vitro [¹⁷]. Quatre ovocytes sur neuf ont atteint le stade de métaphase 2 après 34 heures de maturation in vitro dans nos conditions, tandis que 25 à 35 % des ovocytes équins atteignent ce stade après 24 heures, avec un maximum d’ovocytes en métaphase 2 après 30 heures [¹⁷]. Donc, dans nos conditions, la maturation in vitro des ovocytes d’ânesses semble être plus lente que celle des ovocytes équins. Après 38 heures de maturation in vitro, 25 % des ovocytes d’ânesses contenaient une métaphase 2 qui commençait à se décondenser, signe de dégénérescence, et 25 % étaient dégénérés. D’après ces observations, la durée optimale de maturation in vitro des ovocytes d’ânesses semble être entre 34 et 38 heures et une maturation pendant 38 heures serait déjà trop longue. Toutefois, ces résultats mériteraient d’être confirmés avec un plus grand nombre d’ovocytes, le petit effectif d’ânesses expérimentales disponibles pour les ponctions et les contraintes financières ne nous permettant de collecter qu’une faible quantité de gamètes. Nos données sont en accord avec celles de Zhao et coll. [³⁰]. Abdoon et coll. ont obtenu des taux de maturation in vitro plus élevés après 36 heures (jusqu’à 69 %) [¹]. Ces résultats suggèrent qu’une maturation pendant 36 heures pourrait augmenter le pourcentage d’ovocytes en métaphase 2 par rapport à celle pendant 34 heures. De plus, notre milieu de maturation in vitro n’est peut-être pas optimal pour les ovocytes d’ânesses, et d’autres études sont nécessaires pour améliorer les conditions de maturation in vitro et augmenter le pourcentage d’ovocytes matures.

L’hétérogénéité de maturation des ovocytes d’ânesses observée dans notre étude pourrait être due à la qualité initiale des ovocytes lors de leur collecte, les conditions étant les mêmes pour tous et des variations biologiques étant probables. Cette observation est faite aussi chez la jument.

Conclusion

Pour la première fois, une technique de collecte in vivo d’ovocytes d’ânesses a été développée, avec des taux de récolte élevés, et la chronologie de maturation in vitro des ovocytes d’ânesses a été décrite. Des études sont en cours pour développer une technique de FIV et de culture in vitro des embryons, aucune procédure efficace n’étant disponible chez l’ânesse. Ces travaux vont apporter une contribution importante pour la préservation du patrimoine génétique des races d’ânes sauvages et domestiques en cours d’extinction.

• (1) Longueur 700 mm, diamètre externe 2,3 mm, diamètre interne 1,35 mm, Casmed, Cheam, Surrey, Grande-Bretagne.

• (2) Sonde convexe à balayage mécanique 7,5 MHz, UST-987 Aloka.

• (3) Dulbecco A, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Grande-Bretagne.

• (4) Choay, Sanofi Aventis 5 000 UI/ml.

• (5) 10 mg/ml de détomidine, Centravet, Plancoët.

• (6) 10 mg/ml de butorphanol tartrate et 0,1 mg/ml de benzethonium chlorure, Centravet.

• (7) 4 mg/ml de butylscopolamine, Centravet.

• (8) 170,41 mg/ml de benzylpénicilline, Intervet, Beaucouzé.

• (9) Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier.

• (10) Zeiss.

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