Focus sur les rhabdoviroses réglementées des poissons

Appartenant au genre des Novirhabdovirus et à la famille des Rhabdoviridae (comme le virus de la rage), le virus de la septicémie hémorragique virale (vSHV) et le virus de la nécrose hématopoïétique infectieuse (vNHI) sont économiquement les agents pathogènes viraux les plus importants pour la filière “truite arc-en-ciel” d’élevage en Europe et dans la plupart des régions de l’hémisphère Nord. Ils sont responsables de maladies réglementées en France et en Europe⁽¹⁾ [¹, ⁵, ⁶].

QUELQUES DONNÉES ÉPIDÉMIO-CLINIQUES

Le vSHV est endémique en Europe continentale depuis les années 1960. Ce virus présente un spectre d’espèces hôtes extrêmement large : plus de 80 espèces sensibles sont décrites. Il a notamment été détecté chez de nombreuses espèces de poissons marins vivant dans le milieu sauvage en Europe du Nord [⁷].

À l’inverse, le spectre d’espèces hôtes pour le vNHI est davantage centré sur les salmonidés (environ une vingtaine d’espèces sensibles décrites). Ce virus a été introduit dans les élevages de truites arc-en-ciel en France et en Italie à partir des États-Unis en 1987. Il s’est depuis répandu dans la majeure partie de l’Europe continentale [⁸]. Il n’a jamais été observé dans les principaux pays européens producteurs de saumons (Norvège, Irlande, Écosse, etc.), où il constituerait un danger majeur en cas d’introduction. La transmission est horizontale. Ces virus pénètrent dans l’organisme par les branchies, la base des nageoires ou, éventuellement, à travers les plaies. Une transmission verticale est suspectée pour le vNHI (probablement en surface des œufs), mais n’a pas été clairement démontrée. L’incubation dépend notamment de la température de l’eau, mais également de la dose d’exposition (de quelques jours à une dizaine de jours). Les signes cliniques, qui apparaissent globalement entre 3 à 4 et 14 °C, comprennent une léthargie, une activité anormale, un assombrissement de la peau, une anémie branchiale, un abdomen distendu associé à un œdème au niveau de la cavité péritonéale, une exophtalmie et des hémorragies pétéchiales externes (base des nageoires, branchies, yeux, peau) et internes (muscles) (^{photos 1a} à ^1c).

Les taux de mortalité peuvent atteindre 90 à 100 %. Durant la phase aiguë de la maladie, les particules virales sont retrouvées dans un grand nombre de tissus et organes internes, notamment les reins, le cœur et la rate. Le cerveau est un organe à considérer tout particulièrement chez les individus au stade chronique de l’infection. Les stades les plus sensibles à ces agents pathogènes sont les juvéniles, mais des adultes peuvent également développer des symptômes cliniques, notamment à la suite d’une infection par le vSHV.

DES RHABDOVIRUS EN “BALLE DE FUSIL”

1. Une particularité par rapport aux rhabdovirus de mammifères

Les particules virales associées au vSHV ou au vNHI ont une forme typique en “balle de fusil” et présentent une enveloppe phospho-lipidique. Leurs génomes sont constitués d’une molécule d’ARN monocaténaire de polarité négative d’environ 11 à 12 kilobases codant pour cinq protéines structurales : N (nucléoprotéine), P (protéine associée à la polymérase), M (protéine de matrice), G (glycoprotéine de surface) et L (ARN polymérase ARN-dépendante).

Par rapport aux rhabdovirus de mammifères, les génomes de ces novirhabdovirus possèdent également un cadre ouvert de lecture pour une petite protéine baptisée NV (non virion) qui semble indispensable à la réplication virale en culture cellulaire et qui est impliquée dans la pathogénicité induite par le virus chez la truite arc-en-ciel et dans d’autres espèces.

2. Quatre génogroupes

L’analyse des séquences de certains gènes (G, N, NV) a permis de mettre en évidence l’existence de quatre génogroupes de vSHV (I, II, III, IV). Le génogroupe I est plus particulièrement retrouvé chez les truites arc-en-ciel. Cinq génogroupes de vNHI ont également été recensés (U, M, L, J et E, ce dernier intégrant les souches européennes). Ces génogroupes sont globalement corrélés avec la distribution géographique, plutôt qu’avec l’espèce hôte ou la date d’isolement.

Toutes les souches “poissons” de rhabdovirus réglementés isolées en France sont collectées par le Laboratoire national de référence (LNR) qui réalise systématiquement le séquençage du gène codant la glycoprotéine d’enveloppe.

La comparaison des séquences générées apporte des éléments d’intérêt dans le cadre des enquêtes épidémiologiques menées à la suite des foyers, au travers du calcul des similitudes et du positionnement phylogénétique [⁹]. Le LNR a récemment réalisé une étude de la diversité phylogénétique des souches de vNHI isolées depuis la première détection de cette maladie sur notre territoire, en 1987 [³]. Les populations virales françaises appartiennent toutes au génotype E. Elles ont pu être divisées en huit sous-clades (ou branches) et en quatre isolats individuels, avec une différenciation spatiale nette, suggérant le rôle prédominant de réservoirs locaux dans la contamination.

TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC EXISTANTES ET À VENIR

Plusieurs approches méthodologiques peuvent être utilisées pour rechercher la potentielle origine infectieuse d’une affection observée chez le poisson (^figure). Si les outils permettant la détection et la caractérisation des virus réglementés sont assez bien cadrés, il est souvent intéressant et utile d’en élargir le spectre pour des cas atypiques.

1. Méthode officielle “historique”

La méthode officielle de détection du vNHI et du vSHV dans les tissus de poissons ou les produits génitaux a pendant longtemps reposé sur la mise en culture des échantillons recueillis sur des lignées cellulaires adaptées, suivie, en cas de visualisation d’effets cytopathiques (ECP), d’une identification par immunofluorescence, séroneutralisation ou Elisa (décision abrogée de la Commission européenne 2001/183/CE). Le délai de réponse est long, particulièrement dans le cas d’un résultat négatif (2 semaines).

2. La RT-PCR en voie d’officialisation

Une décision européenne récente (2015) enrichit le panel d’outils de détection officiels en donnant la possibilité de rechercher le vNHI et le vSHV directement par une technique moléculaire de reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RT-PCR) en temps réel [⁵]. Cette méthode est fondée sur l’utilisation d’amorces et de sondes spécifiques de chaque virus marquées avec des fluorochromes. La détection d’une fluorescence dans l’échantillon analysé atteste de la présence du fragment d’ARN viral ciblé et la précocité de détection (nombre de cycles d’amplification à partir duquel l’émission de fluorescence est significative) donne une idée de la quantité relative (la “charge virale”). Afin d’accompagner les laboratoires agréés dans cette évolution méthodologique, le LNR est en train de développer et de valider des systèmes spécifiques de ces deux virus. L’objectif est de disposer de méthodes rapides présentant un niveau de performance au moins équivalent à celui de la culture cellulaire ainsi que toutes les garanties de fiabilité. Une première méthode spécifique du vNHI a été validée en 2017. Elle intègre, en complément d’un contrôle qualité d’extraction cible exogène (broyat d’organe sain dopé avec une quantité connue de vNHI et analysé en parallèle des échantillons), un système original de contrôle d’extraction non-cible fondé sur l’utilisation d’un bactériophage à ARN ajouté à chacun des échantillons en amont de l’analyse. Ces contrôles, couplés à des témoins positifs et négatifs de RT-PCR, permettent de vérifier la bonne réalisation des étapes d’extraction (récupération et purification des ARN viraux potentiellement présents dans la matrice analysée) et d’amplification (RT-PCR). La méthode équivalente pour le vSHV est en phase de développement. Ces procédures seront soumises à la Direction générale de l’alimentation (DGAL) pour officialisation.

Le gain majeur pour les demandeurs d’analyses sera surtout perceptible en cas d’échantillons négatifs, avec un délai de réponse de l’ordre de 24 à 72 heures. Ces RT-PCR ne pourront néanmoins détecter que les virus spécifiques des couples d’amorces et de sondes utilisées, alors que la culture cellulaire, par essence, ouvre le champ à une recherche plus large, détectant l’ensemble des virus générant des effets cytopathiques visibles (destruction de tapis cellulaire, cellules géantes, cratères localisés, etc.) au microscope inversé.

Les méthodes à mettre en œuvre doivent donc être réfléchies au cas par cas, en fonction du contexte, afin de maximiser les chances d’identifier l’agent infectieux.

3. Méthodes indirectes de sérologie

Les méthodes indirectes de sérologie ont pour principe de détecter des preuves de la présence, à un moment de la vie du poisson, d’un agent pathogène particulier en se fondant notamment sur la mise en œuvre chez l’animal infecté d’une réponse immunitaire humorale spécifique. Des méthodes Elisa et de séroneutralisation existent pour le vSHV et le vNHI, mais également pour d’autres virus comme le virus de la nécrose pancréatique infectieuse (vNPI), les alphavirus de la maladie du sommeil ou du pancréas des salmonidés ou le virus de l’encéphalopathie et de la rétinopathie (VER ou nodavirus). Le LNR, associé à des partenaires européens, a proposé en 2017 une méthode de séroneutralisation spécifique de l’herpèsvirus de la carpe Koi (KHV) et démontré sa capacité à détecter des anticorps durant plus de 25 mois postinfection [⁴]. En raison des connaissances encore insuffisantes sur les mécanismes immunitaires mis en jeu chez le poisson en réponse à des infections et sur la persistance des réponses spécifiques, ces méthodes n’ont pas, pour le moment, de reconnaissance officielle. Elles sont néanmoins régulièrement utilisées pour caractériser le statut de populations de géniteurs ou détecter la présence d’anticorps à la suite d’un foyer infectieux.

Ces techniques permettent une analyse individuelle avec une lecture à l’échelle de la population. Elles sont non invasives, contrairement aux méthodes directes qui nécessitent le sacrifice d’un certain nombre d’animaux.

4. Méthodes “NGS”

Une nouvelle génération de méthodes de séquençage (NGS) présente un intérêt grandissant en virologie des poissons où, en raison du nombre très important d’espèces, d’écosystèmes et d’échanges commerciaux, les virus inconnus ou émergents sont fréquents. Outre l’appui à l’identification et/ou au positionnement par rapport à la taxonomie actuelle, le séquençage complet de génomes de virus connus comme le vSHV ou le vNHI peut également permettre d’identifier, en utilisant des approches complémentaires de génétique inverse et des infections expérimentales in vivo, des positions nucléotidiques particulières impliquées dans la virulence des souches [²].

Conclusion

En définitive, les résultats de la surveillance réalisée ces dernières années en France mettent en évidence une situation sanitaire stable sur le territoire vis-à-vis de la SHV et de la NHI, avec la détection récurrente de quelques cas chaque année (3 en 2015 et en 2016, 4 en 2017). Un plan national d’éradication de surveillance (PNES) de ces maladies, coordonné par la DGAL et développé en collaboration avec les professionnels, a été lancé en 2017 avec pour objectif de rendre indemne de ces deux virus le territoire national à l’horizon 2021, facilitant ainsi les échanges commerciaux.

Outre ces agents pathogènes bien connus pour lesquels des activités de recherche et développement, notamment au niveau des outils de diagnostic moléculaires, sont en cours, un challenge majeur pour l’avenir consistera à être réactif dans la détection et l’évaluation d’autres dangers susceptibles d’émerger au sein de la filière aquacole mondiale, en pleine expansion.

• (1) Voir l’article “Quels dangers sanitaires pour la filière piscicole française ?” des mêmes auteurs, dans ce numéro.

Références

• 1. Arrêté du 29 juillet 2013 relatif à la définition des dangers sanitaires de première et deuxième catégorie pour les espèces animales. JORF n° 0187 du 13 août 2013, page 13832. https://www.legifrance.gouv.fr/affichTexte.do?ci dTexte=JORFTEXT000027831750&categorieLien=id
• 2. Baillon L, Mérour E, Cabon J et coll. A single amino acid change in the non-structural NV protein impacts the virulence phenotype of viral hemorrhagic septicemia virus in trout. J. Gen. Virol. 2017;98 (6):1181-1184. doi:10.1099/ jgv.0.000830
• 3. Bellec L, Louboutin L, Cabon J et coll. Molecular evolution and phylogeography of infectious hematopoietic necrosis virus with a focus on its presence in France over the last 30 years. J. Gen. Virol. 2017. doi:10.1099/jgv.0.000894
• 4. Cabon J, Louboutin L, Castric J et coll. Validation of a serum neutralization test for detection of antibodies specific to cyprinid herpesvirus 3 in infected common and koi carp (Cyprinus carpio). J. Fish Dis. 2017;40 (5):687-701. doi:10.1111/jfd.12550.
• 5. Décision d’exécution (UE) 2015/1554 de la Commission du 11 septembre 2015 portant modalités d’application de la directive 2006/88/CE en ce qui concerne les exigences relatives à la surveillance et aux méthodes de diagnostic.
• 6. Directive 2006/88/CE du 24 octobre 2006 du Conseil relative aux conditions de police sanitaire applicables aux animaux et aux produits d’aquaculture, et à la prévention de certaines maladies chez les animaux aquatiques et aux mesures de lutte contre ces maladies.
• 7. OIE. Manual of diagnostic tests for aquatic animals. Chapter 2.3.10. Viral haemorrhagic septicaemia. 2017. http://www.oie.int/index. php?id=2439&L=0&htmfile=chapitre_vhs.htm
• 8. OIE. Manual of diagnostic tests for aquatic animals. 2017. Chapter 2.3.4. Infectious haematopoietic necrosis. http://www.oie.int/index. php?id=2439&L=0&htmfile=chapitre_ihn.htm
• 9. Roman T, Cabon J, Baud M et coll. Surveillance des dangers sanitaires de première catégorie pour les poissons en 2015 : la stabilisation constatée en 2014 se confirme.