Comment bien réaliser et interpréter un dosage hormonal à la clinique

Les dysendocrinies sont des maladies fréquentes chez le chien et le chat. Les signes cliniques et biochimiques évocateurs d’une dysendocrinie sont peu pathognomoniques et le diagnostic de certitude nécessite la réalisation de dosages hormonaux. Le dosage de progestérone chez la chienne est aussi très largement utilisé pour déterminer la phase du cycle dans laquelle elle se trouve, déterminer la période d’ovulation ou prévoir la mise bas.

Les dosages hormonaux peuvent être réalisés en laboratoire vétérinaire spécialisé. Cependant, même si le délai de réponse reste en général assez court (24 à 48 heures), un tel délai peut être problématique dans certaines situations (lors des suivis de gestation, par exemple) ou lorsqu’un résultat rapide est souhaité. De plus, la législation actuelle interdit désormais les dosages en laboratoire d’analyses médicales humaines (sauf circuit et personnel vétérinaires dédiés), qui avaient l’avantage, par leur proximité, de fournir un résultat de dosage rapidement. Ainsi, de plus en plus de cliniques vétérinaires sont maintenant équipées pour réaliser les dosages hormonaux et plusieurs compagnies proposent des analyseurs donnant des valeurs quantitatives (^tableau, encadré 1).

La méthode de dosage immunologique peut varier entre analyseurs. Connaître les techniques utilisées peut permettre de mieux appréhender et interpréter les résultats obtenus ainsi que les facteurs pouvant les influencer. Cet article présente de manière synthétique les différents paramètres techniques, physiologiques et/ou pathologiques pouvant influencer un dosage hormonal ou son interprétation.

ANALYSEURS EN CLINIQUE

1. Hormones mesurables chez le chien et le chat et intérêt clinique

Presque tous les analyseurs disponibles en clinique peuvent mesurer la thyroxine (ou T4) totale. Cette hormone est recherchée lors d’une suspicion d’hypothyroïdie (majoritairement chez le chien) ou d’hyperthyroïdie (majoritairement chez le chat). En cas de suspicion d’hypothyroïdie, le dosage de TSH (thyroid stimulating hormone ou thyréostimuline) canine (disponible sur un analyseur) est indispensable afin d’établir un diagnostic de certitude [⁹].

La mesure de la T4 libre (< 1 % de la T4) peut également être intéressante lors de suspicion d’hypothyroïdie [⁹]. Cependant, la technique de ce dosage nécessite des laboratoires vétérinaires spécialisés.

Le dosage de la triiodothyronine (ou T3), proposé par un analyseur, n’a, en revanche, que peu d’intérêt en termes de diagnostic.

Le cortisol est aussi couramment mesuré dans le cadre du diagnostic de l’hypercorticisme (primaire ou onctionnel) ou de l’hypocorticisme et plusieurs analyseurs sont capables de le doser [⁶, ⁹].

Doser l’ACTH (adrenocorticotrophic hormone ou hormone corticotrope) basal ne permet pas de diagnostiquer un hypercorticisme, mais peut donner une indication sur son étiologie (concentration supérieure à la limite de détection lors de tumeur hypophysaire) [⁹]. Alors que ce dosage requiert généralement des méthodes spécifiques et une gestion préanalytique rigoureuse, un analyseur le propose néanmoins.

Le dosage de la progestérone est un outil extrêmement intéressant pour déterminer la période de fertilité optimale chez la chienne (non standardisé chez la chatte), avoir une idée de la date de mise bas ou encore détecter des insuffisances lutéales. Pourtant, assez peu d’analyseurs proposent ce dosage [²].

Les dosages de testostérone et/ou d’œstradiol, possibles sur un des analyseurs disponibles en clinique, associés ou non au dosage de progestérone, peuvent être utiles pour diagnostiquer des hypogonadismes ou tumeurs testiculaires chez le mâle ou encore des troubles de la fertilité et de rémanences ovariennes chez la femelle.

Le dosage de l’insuline, possible sur un des analyseurs, n’a que peu d’intérêt pour le diagnostic du diabète sucré (sauf chienne en diœstrus). Néanmoins, son dosage peut être intéressant pour mettre en évidence des états prédiabétiques dans un contexte d’obésité/syndrome métabolique et peut permettre de raisonner le traitement d’un diabète sucré dans le cas d’échecs thérapeutiques répétés. Lors d’hypoglycémie, la mesure du rapport glycémie/ insulinémie sur au moins quatre prélèvements à jeun peut être utile au diagnostic d’insulinome [⁹, ¹¹].

2. Techniques utilisées par les analyseurs

En raison de la très faible quantité d’hormones présentes dans le sang (de l’ordre de 10^-9 à 10^-12 mol/l de sang, quelle que soit l’hormone considérée), il est indispensable d’avoir recours à des dosages spécifiques ondés sur des réactions immunologiques utilisant un anticorps spécifique de l’hormone à doser, associés à un marquage puissant pour la mise en évidence de la liaison anticorps/ antigène. Différentes méthodes de détection et de révélation sont utilisées et peuvent se réaliser sur phase solide (l’anticorps est fixé de façon irréversible sur un support solide) ou liquide.

Ces techniques de détection et d’amplification nécessitent une spécificité et une sensibilité de l’anticorps pour l’hormone et un seuil de détection très bas. Outre les conditions préanalytiques, la précision des valeurs obtenues en endocrinologie dépend entièrement de ces paramètres et varie considérablement de celle obtenue avec un analyseur de marqueurs biochimiques. Les valeurs usuelles choisies pour l’appareil restent alors très relatives et il est important de tenir compte de cette imprécision pour interpréter un dosage hormonal. En endocrinologie, un coefficient de variation (CV, facteur déterminant la précision) autour de 15 % est généralement acceptable pour un analyseur en clinique. Cela signifie que pour une valeur de 100 nmol/l, une nouvelle mesure de l’échantillon a 68 % de chances de se situer entre 85 (100 – 1 × CV) et 115 (100 + 1 × CV) nnmol/l et 95 % dans l’intervalle compris entre 70 (100 – 2 × CV) et 130 (100 + 2 × CV) nmol/l.

Techniques de détection et révélation

Pour les automates disponibles en clinique vétérinaire, la liaison anticorps/ hormone peut être révélée par :

– des enzymes aboutissant à la génération d’une molécule colorée ou luorescente ;

– des nanoparticules fluorescentes (encadré 2, ^{figure 1}).

D’autres méthodes de détection telles que la chimiluminescence (l’enzyme génère une molécule luminescente) ou la radioactivité existent, mais aucun analyseur disponible en clinique ne les utilise.

Détection directe ou indirecte

La détection des molécules marquées peut se faire par méthode directe ou indirecte (dite par compétition) (^{figure 2}).

Dans la méthode directe ou immunométrique, l’anticorps marqué, présent en excès, s’associe à l’hormone présente dans l’échantillon. Parfois, deux anticorps différents sont utilisés : un primaire, qui reconnaît l’hormone, et un secondaire, marqué, qui reconnaît soit l’anticorps primaire, soit l’hormone sur un épitope différent (l’hormone est alors prise “en sandwich” entre les deux anticorps). Dans tous les cas, la quantité de substrat coloré ou la fluorescence est donc directement proportionnelle à la quantité d’hormone présente.

Dans la méthode indirecte, un analogue de l’hormone (appelé traceur), couplé ou non à un marqueur, est présent dans le réactif (ou sur le support solide). Cet analogue, de concentration connue, va entrer en compétition avec l’hormone qui se trouve dans l’échantillon. Plus la quantité d’hormone est importante dans l’échantillon, moins l’analogue peut se fixer aux anticorps. La quantité de substrat coloré ou la fluorescence est donc inversement proportionnelle à la quantité d’hormone.

La mesure obtenue est alors comparée à celle d’une courbe de référence réalisée à partir d’échantillons contrôles de concentration connue (au moins deux niveaux de concentration différents).

Support de détection : solide ou liquide

La majorité des analyseurs utilise un support solide sur lequel les anticorps spécifiques de l’hormone, ou l’analogue, sont fixés de façon irréversible. L’échantillon et le ou les réactifs migrent sur cette membrane et les éléments ne s’étant pas fixés sont éliminés par différents rinçages ou absorbés sur des couches différentes. Seuls les éléments s’étant fixés seront alors détectés.

Lors de réactions en phase aqueuse, les complexes hormone-anticorps peuvent être précipités par du polyéthylène glycol, par exemple, ou alors la fraction restée libre (par exemple : hormone marquée non ixée aux anticorps) est adsorbée (par du charbon, par exemple) et centrifugée pour séparer les phases.

Cas particulier de la T4 libre

En laboratoire vétérinaire, deux procédés peuvent être utilisés pour la mesure de la T4 libre. L’un utilise un analogue de la T4 libre uniquement (et non de la T4 liée) comme traceur pour un dosage par compétition (cas des analyseurs en clinique), l’autre une méthode modifiée de dialyse, la dialyse à l’équilibre, qui est considérée comme la référence. Des études ont mis en évidence que la méthode modifiée de la dialyse à l’équilibre était la méthode commerciale la plus exacte pour mesurer la T4 libre. Les méthodes par compétition ont montré des résultats variables selon les trousses de dosage utilisées : certaines corrèlent favorablement avec la méthode modifiée de la dialyse à l’équilibre, alors que d’autres n’apportent pas plus d’informations que le dosage de la T4 totale [¹³]. La RIA (radioimmunoassay) est aussi une méthode de référence pour mesurer la T4 libre.

3. Évaluer les performances de l’analyseur

Paramètres analytiques de l’analyseur

Les différents paramètres analytiques de l’analyseur sont son exactitude (justesse et fidélité), sa précision (répétabilité et reproductibilité), sa sensibilité et sa spécificité (encadré 3, ^{figure 3}).

Études de validation (sensibilité et spécificité diagnostique)

→ Les études de corrélation visent à comparer plusieurs échantillons dosés avec l’analyseur évalué et une méthode de référence qui a déjà fait ses preuves (les méthodes utilisant la chimiluminescence ou la radioactivité, par exemple). En rapportant les valeurs obtenues sur un graphe, il est alors possible de tracer une droite de régression, se rapprochant le plus possible des points, et d’en déterminer le coefficient de corrélation R. Plus ce coefficient R (ou R²) est proche de 1, plus la corrélation entre les méthodes est bonne (^{figure 4}).

→ Les études cliniques (associées ou non à la corrélation avec une autre méthode) permettent de corréler la concentration hormonale avec l’état clinique ou physiologique (pour la progestérone, par exemple) de l’animal. Ces études, difficiles à mettre en œuvre, sont toutefois intéressantes pour la validation des valeurs de référence choisies par le fabricant.

→ Les valeurs de référence (ou valeurs usuelles) qui sont fournies avec l’automate proviennent généralement d’études de corrélation (en tenant compte du rapport obtenu entre les deux méthodes) ou, plus rarement (car chronophage et coûteux), d’études réalisées de novo en sélectionnant un groupe d’animaux sains (au moins 120 animaux selon les recommandations de l’American Society for Veterinary Clinical Pathology (ASVCP) [⁴]). Des valeurs de référence provenant de données scientifiques ne peuvent être prises en compte puisqu’elles n’utilisent pas les valeurs obtenues avec l’analyseur en question. Or une grande variabilité existe entre les méthodes utilisés et les analyseurs. De plus, ces valeurs usuelles peuvent avoir été obtenues à partir d’un groupe d’animaux (exemple : jeunes mâles de race beagle) ne reflétant pas la population d’animaux sur lesquels les tests sont réalisés.

COMMENT BIEN RÉALISER UN DOSAGE HORMONAL À LA CLINIQUE

1. Bien préparer son échantillon : la phase préanalytique

Les dosages hormonaux en clinique se font généralement à partir de sérum et peuvent parfois être réalisés sur du plasma, voire à partir de sang total si l’analyseur contient une centrifugeuse intégrée (encadré 4, ^{photo 1}).

2. Respecter les conditions d’utilisation et de conservation

→ La dégradation de l’hormone dans l’échantillon collecté dépend de l’hormone et de la température de conservation. Les hormones thyroïdiennes et stéroïdes sont généralement stables, même à température ambiante, mais il est toutefois recommandé de récolter le plasma ou le sérum dans un tube sec à maintenir à + 4 °C si l’analyse n’est pas réalisée dans l’heure. D’autres hormones telles que l’insuline ou l’ACTH sont moins stables et requièrent un maintien au froid dès le prélèvement et/ ou l’utilisation de conservateurs tels que l’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) ou l’aprotinine.

→ Les réactifs (bandelettes de support, réactifs contenant les anticorps, etc.) doivent eux aussi généralement être maintenus au froid (+ 4→°C) ou au congélateur (- 20→°C) afin de préserver l’activité enzymatique, la conformation des anticorps et autres molécules intervenant dans le dosage (traceur, etc.) et d’empêcher leur dégradation.

Toutefois, la plupart des analyseurs ayant été étalonnés à température ambiante, il est souvent impératif de remettre l’échantillon à doser et les réactifs à température ambiante. La cinétique et le maintien de la fixation anticorps-antigène dépendent beaucoup, en effet, de la température.

→ Enfin, il est aussi extrêmement important de respecter les conditions d’utilisation de l’appareil pour les dosages telles qu’elles sont décrites dans la notice de l’analyseur (volumes, procédure, rinçages, dilutions, etc.). Les études de fiabilité ont, en effet, été réalisées dans ces conditions précises d’utilisation et toute déviation dans le protocole peut induire une mauvaise lecture et une interprétation erronée.

3. Facteurs pouvant interférer avec la technique et la lecture du test

Qualité du prélèvement

Outre le tube utilisé pour le prélèvement, certains éléments présents dans l’échantillon peuvent modifier la mesure. Il est donc important de s’assurer que l’échantillon est bien homogène et de réaliser un pipetage propre et précis. La présence de cellules sanguines dans le sérum ou le plasma (lors de séparation mal faite, centrifugation trop courte, pipetage du sérum mal réalisé, etc.) peut considérablement altérer la migration sur le support solide ou l’absorption par les différentes couches. Les cellules sanguines peuvent aussi colorer l’échantillon (de même qu’un échantillon lipémique ou hémolysé) et ainsi interférer avec les méthodes de détection par spectrophotométrie (^{photo 2}). En influençant les interactions moléculaires, les concentrations ioniques ou protéiques élevées de l’échantillon peuvent aussi modifier le résultat.

Présence d’anticorps (et autoanticorps) dans l’échantillon

Les anticorps antithyroglobuline, présents chez certains chiens atteints de thyroïdite lymphoplasmocytaire, peuvent parfois s’associer à la T4 dans le prélèvement et modifier ainsi sa concentration.

Température de conservation

La température ambiante peut influencer le résultat pour les raisons citées plus haut (cinétique, affinité, etc.).

Consommables et entretien de l’analyseur

Une dégradation même minime des consommables (plaquettes ou réactifs) ou de l’analyseur peut considérablement altérer le résultat.

COMMENT INTERPRÉTER UN DOSAGE HORMONAL À LA CLINIQUE

1. Interpréter les résultats en fonction des valeurs usuelles de l’automate

Afin d’interpréter de manière adéquate la mesure réalisée par l’automate, il est important de se référer aux valeurs usuelles fournies. En effet, tous les analyseurs sont étalonnés de manière différente et utilisent des méthodes différentes, si bien que les valeurs usuelles diffèrent d’un automate à l’autre, même si la corrélation (R) entre ces deux appareils est excellente. Dans la mesure du possible, il est recommandé de réaliser le suivi d’un animal toujours sur le même appareil.

2. Prendre en compte les limites analytiques de l’automate

Il est indispensable d’interpréter les concentrations obtenues avec les signes cliniques et biologiques (frottis vaginal pour le suivi de reproduction, par exemple), notamment lorsque la concentration obtenue est proche des limites de l’intervalle de référence (ou juste en dehors). Aucun analyseur n’est précis à 100 % et un même échantillon dosé à plusieurs reprises donne à chaque fois des résultats légèrement différents. Ainsi, une concentration obtenue juste en dessous de la valeur seuil de décision diagnostique peut se retrouver juste au-dessus lors d’un nouveau dosage du même échantillon.

L’obtention d’une valeur douteuse avec présence de signes très évocateurs d’une maladie doit amener à réitérer le dosage ou à entreprendre d’autres examens complémentaires.

3. Prendre en compte le contexte physiologique et clinique

L’interprétation d’un résultat de dosage hormonal doit être réalisée en fonction des commémoratifs et de l’anamnèse de l’animal et de la présence éventuelle d’une autre maladie concomitante. Ainsi, la concentration hormonale (T4 totale, par exemple) va être influencée par de nombreux acteurs physiologiques (variation au cours de la journée, race, âge, cycle, stress), l’état d’avancement et la sévérité de la ou des maladies ou encore les traitements reçus (glucocorticoïdes, anti-inflammatoires non stéroïdiens, sulfamides, phénobarbital, antidépresseurs tricycliques, etc.) [¹, ⁵, ⁷, ⁸-¹⁰, ¹⁴]. Le système endocrinien est très complexe : d’abord il existe de nombreuses interactions avec le système nerveux central et immunitaire, et au sein même du système endocrinien, aucune fonction endocrine n’est indépendante. Par exemple, la fonction thyroïdienne est déprimée par de nombreux facteurs et toute maladie chronique : hypercorticisme, diabète sucré, maladie rénale chronique, maladie hépatique, cancer, affections gastro-intestinales, infections chroniques, hypocorticisme, hyperœstrogénisme, etc. [³, ⁸, ¹²].

Il s’agit donc de bien différencier les dysendocrinies primaires et fonctionnelles (c’est-à-dire sans atteinte primaire de la glande ou des cellules endocrines sécrétantes), afin d’évaluer les conséquences physiopathologiques et de mesurer les bénéfices et les risques d’un traitement hormonal.

4. Que faire en cas de résultat incohérent ?

→ Un résultat aberrant, non corrélé à la clinique ou aux examens complémentaires, doit alerter et amener à se poser les bonnes questions. La première étape est de vérifier les éléments préanalytiques et analytiques. Lors d’un test de stimulation ou de freinage, la procédure de ce test et la validité des consommables (conservation, péremption) doivent aussi être vérifiés.

→ Il convient aussi de s’intéresser aux acteurs biologiques (autres maladies, médicaments, variations journalières et individuelles, état physiologique [diœstrus], etc.) et techniques (précision de l’appareil, interférence avec la technique, etc.) pouvant modifier le résultat avant de considérer que l’analyseur est en cause.

→ Enfin, si aucune maladie ne peut expliquer le résultat, il est nécessaire de réaliser des examens complémentaires, afin d’affiner le diagnostic ou de répéter les analyses quelques jours ou semaines plus tard pour confirmer une éventuelle suspicion.

→ Si les résultats incohérents se répètent, il est alors nécessaire de contacter le fabricant. L’analyseur peut être vérifié à l’aide de solutions contrôles, en analysant les données brutes de l’appareil ou en le comparant à une méthode de référence en laboratoire externe.

Conclusion

Ainsi, plusieurs paramètres peuvent influencer l’analyse, que ce soit d’un point de vue technique ou biologique et il est important de prendre ces éléments en compte lors de l’interprétation des données.

Les analyseurs disponibles en clinique utilisent des méthodes immunologiques différentes. Si les paramètres de ces analyseurs (sensibilité, précision, etc.) ne sont pas toujours disponibles, les études de corrélation le sont (ou devraient l’être) et peuvent donner une bonne idée de leur fiabilité. Des études (comparatives ou cliniques) réalisées sur le terrain ou avec des experts sont des garanties supplémentaires. Enfin, l’avis d’un confrère est toujours intéressant à partir du moment où celuici a bien mesuré l’importance de la phase préanalytique et du respect du protocole analytique.

Références

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