Séquençage NGS : applications pratiques en médecine vétérinaire

Chaque agent pathogène possède un patrimoine génétique propre qui lui confère notamment des propriétés de pathogénicité, de virulence, et constitue la base de son identification par les techniques de biologie moléculaire comme la PCR (polymerase chain reaction).

La détermination d’une partie ou de l’ensemble de ce patrimoine génétique est réalisée par les techniques dites de séquençage. Mises au point en 1977 par les équipes de Frederik Sanger, ces techniques ont évolué récemment pour augmenter la quantité d’informations (nombre de parties de génome déterminées par série ou nombre d’isolats séquencés en même temps) tout en réduisant les délais d’analyse et en augmentant la précision des séquences établies. Les techniques de séquençage de troisième génération, ou Next Generation Sequencing (NGS), contribuent ainsi à améliorer l’identification et l’étude épidémiologique des agents pathogènes. Elles ouvrent également, par le biais de la métagénomique, des perspectives en termes de description du microbiome (ensemble des agents pathogènes présents) dans les affections complexes ou dans la détection de nouveaux agents pathogènes. Si les techniques NGS commencent à être largement utilisées en médecine humaine, par exemple en cancérologie, en génétique ou en infectiologie, elles demeurent encore peu connues en médecine vétérinaire et limitées à des projets de recherche associant l’Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail (Anses), les écoles vétérinaires et/ou l’Institut national de la recherche agronomique (Inra). Pourtant, des applications concrètes existent déjà⁽¹⁾.

PRINCIPE DU SÉQUENÇAGE NGS

Les premières techniques de séquençage, ou séquençage de type Sanger, sont fondées sur la détermination, pour un seul isolat à la fois, d’une séquence unique du génome, ciblée et amplifiée au préalable par une PCR donnée (^{figure 1}). Le séquençage de troisième génération amplifie des séquences ciblées ou des séquences inconnues avec une capacité de démultiplication des données, ce qui peut aller jusqu’à des dizaines de millions de séquences sur une même série d’analyses.

Le séquençage NGS permet de multiplier à la fois le nombre d’isolats séquencés par série (multiplexage d’échantillons) et le nombre de cibles séquencées (jusqu’à la description du génome complet). Il peut également être utilisé sans connaissance préalable des séquences, voire du pathogène cible.

Ainsi, le génotypage du virus de la diarrhée virale bovine ou bovine virale diarrhea (BVD), actuellement réalisé par la méthode Sanger, est effectué isolat par isolat et nécessite deux séquençages en parallèle avec, d’une part, la description de la séquence 5’UTR et, d’autre part, celle du gène Npro. La technique NGS permet, sur la même analyse, d’étudier plusieurs souches du virus BVD simultanément et sur un nombre qui peut, en théorie, être illimité de séquences, affinant ainsi le génotypage en deçà du type et du sous-type jusqu’aux espèces et quasi-espèces. C’est à l’aide des techniques NGS que des agents responsables de pathologies animales émergentes, comme le virus Schmallenberg, ont pu être identifiés rapidement⁽²⁾.

APPLICATIONS PROPOSÉES EN MÉDECINE VÉTÉRINAIRE

1. Génotypage multiple sur sequences ciblées

Lorsque les séquences d’intérêt diagnostique ou épidémiologique sont connues pour un agent pathogène donné, les techniques NGS permettent de multiplier les séquences afin d’affiner le génotypage d’une souche. Par exemple, pour le virus BVD, il est possible de rechercher en même temps et pour différents isolats, à la fois les séquences permettant d’identifier les trois types viraux (BVD 1, BVD 2 ou BVD 3) et leurs différents sous-types associés (séquence 5’UTR et gène Npro), les séquences cibles des anticorps neutralisants (gène E2) et les marqueurs génétiques de certaines souches vaccinales.

2. Séquençage de novo du génome complet

Lorsque les séquences d’intérêt diagnostique ou épidémiologique ne sont pas connues, un séquençage de novo de l’ensemble du génome peut être réalisé. Cette technique a été choisie pour le génotypage et l’étude des facteurs de virulence d’une souche de BoHV4 isolée en Saône-et-Loire dans le cadre de foyers de métro-péritonite létale (^{figure 2}).

3. Métagénomique

Les analyses de métagénomique décrivent l’ensemble des agents, pathogènes ou non, présents au sein d’un seul échantillon. Ces analyses sont, par exemple, utilisées en médecine humaine pour identifier, sans a priori, les agents responsables de cas de fièvre chronique. Elles permettent un gain de temps considérable en comparaison de la mise en œuvre d’une batterie de tests moléculaires spécifiques de chaque agent pathogène. Ce sont des techniques de diagnostic dites “ouvertes” dans la mesure où elles peuvent aboutir à la mise en évidence de nouveaux agents non encore décrits.

Dans le domaine vétérinaire, elles sont essentiellement utilisées par des équipes de recherche (Inra, écoles vétérinaires) ou dans le cadre de projets en cours (Anses). Dans le cadre de maladies multifactorielles (affections respiratoires) ou multi-agents (avortements), elles permettent, par exemple, de décrire de manière exhaustive le microbiome présent chez des animaux cliniquement sains et malades, et d’identifier l’ensemble des agents pouvant être liés à telle ou telle affection.

Une application diagnostique est proposée⁽³⁾ dans le cadre des mammites bovines (^{figure 3} et encadré 2). Le séquençage simultané de plusieurs laits de mammites sur des régions variables du gène codant l’ARN ribosomique 16S bactérien (gène utilisé pour la classification taxonomique des bactéries) permet d’identifier simultanément l’ensemble de la flore bactérienne présente sur plusieurs échantillons et de déterminer la proportion relative de chaque bactérie par échantillon.

Conclusion

La technologie NGS représente une technique innovante qui ouvre de nouveaux horizons en médecine vétérinaire.

Encore actuellement, les limites du NGS sont le coût de l’équipement (qui dépend du volume d’activité, mais qui entraîne un coût de prestation⁽⁴⁾), et la nécessité d’un personnel hautement qualifié et d’une plateforme bio­informatique très performante (serveurs, accès Internet de très haut débit, etc.).

Dans un futur proche, il est fortement envisageable que le NGS évolue vers une simplification technologique et qu’il devienne, comme la PCR en temps réel, un outil utilisable pour le diagnostic des affections animales pour toutes les espèces [¹].

• (1) Elles sont proposées par Biosellal, récente société spécialisée dans ce domaine à Lyon (Rhône).

• (2) L’identification formelle d’un agent pathogène passe par la reproduction de la maladie ; le NGS n’est qu’un des outils, puissant, pour l’identification d’un agent infectieux.

• (3) Par Biosellal.

• (4) Le coût est supérieur à celui du séquençage de type Sanger. Cependant, il reste relatif car le Sanger ne peut séquencer qu’un seul fragment de gène, alors que le NGS apporte davantage d’informations (plusieurs gènes ou fragments de gènes, voire le génome complet).

• (1) Par Biosellal.

Références

• 1. Check-Hayden E. Pint-sized DNA sequencer impresses first users. Nature. 2015;521:15-16.
• 2. Pez F. Les nouvelles techniques de séquençage : NGS. Journée de présentation et d’échange sur l’étude épidémiologique et génomique du BoHV-4 en Bourgogne, Lyon. 4 décembre 2014: 57-72.
• 3. Punetha J, Hoffman EP. Short Read (Next-Generation) Sequencing. A tutorial with cardiomyopathy diagnostics as an exemplar. Circulation: cardiovascular genetics. 2013;6:427-434. http://circgenetics.ahajournals.org/content/6/4/427.full

ENCADRÉ 1
Les séquençages de type Sanger et de 3^e génération

→ Le séquençage de type Sanger cible une région précise du génome et l’amplifie par une première étape de PCR (polymerase chain reaction). La réaction de séquençage (ou PCR de séquençage) s’effectue à partir de la séquence amplifiée et consiste à recopier des fragments de taille variable, la copie s’arrêtant lors de l’incorporation d’un nucléotide (unité constituant l’ADN [acide désoxyribonucléique], il existe quatre sortes de nucléotides A, T, G, C) marqué par un fluorochrome. Une électrophorèse permet de séparer les fragments selon leur taille, du plus petit (début de la séquence) au plus grand (totalité de la séquence recopiée). La lecture du dernier nucléotide de chaque fragment permet d’établir un chromatogramme et de décrire la séquence.

→ Le séquençage de troisième génération (next generation sequencing ou NGS) consiste à fragmenter le génome de chaque échantillon selon des fragments de taille homogène. Le cas échéant, un enrichissement des séquences à déterminer est réalisé par PCR.

Une librairie de séquences est constituée par ajout d’adaptateurs aux fragments d’ADN. Ces adaptateurs sont utilisés également pour distinguer plusieurs échantillons entre eux avant leur pool. La librairie de séquences est immobilisée sur un support solide par les adaptateurs et une première étape consiste à amplifier chaque fragment de façon clonale (formation de clusters). Le séquençage correspond alors à la lecture des clones de séquence et génère des dizaines de millions de séquences pour un échantillon donné. L’analyse bio-informatique de ces multiples données est réalisée à l’aide de logiciels dédiés et peut nécessiter une quinzaine de jours.

D’après [³].

ENCADRÉ 2
Applications proposées en routine

Deux applications sont actuellement proposées en routine⁽¹⁾ :

– le séquençage de près de 50 % du génome du virus du syndrome dysgénésique et respiratoire du porc (SDRP) (six gènes impliqués dans la réaction immunitaire de l’hôte) ;

– le séquençage du coronavirus du porc (porcine epidemic diarrhea virus ou PEDV). L’intégralité du gène S1 est séquencée, ce qui permet de différencier les différents variants.

Ces deux analyses sont effectuées pour un prix hors taxe compris entre 200 et 250 € par échantillon. Deux applications sont en cours de développement et seront possibles prochainement : les séquençages du coronavirus des volailles et des pestivirus des ruminants.