Utilisation possible des analyses de tank pour le diagnostic épidémiologique des mammites bovines - Le Point Vétérinaire expert rural n° 326 du 01/06/2012
Le Point Vétérinaire expert rural n° 326 du 01/06/2012

ESPÈCES ET GROUPES BACTÉRIENS DANS LE LAIT

Article de synthèse

Auteur(s) : Francis Sérieys*, Marylise Le Guénic**

Fonctions :
*Filière blanche,
12, quai Duguay-Trouin, 35000 Rennes
francis.serieys@wanadoo.fr
**Chambre d’agriculture de Bretagne,
BP 398, 56009 Vannes Cedex
marylise.leguenic@bretagne.chambagri.fr

Les analyses sur lait de tank permettent un premier screening pour les seules espèces bactériennes inféodées à la mamelle.

Produit par le troupeau, collecté, mélangé et transformé par la laiterie, le lait de tank fait l’objet d’un échange de matière et d’argent entre producteur et transformateur.

Le paiement du lait “à la qualité”, rendu obligatoire par la loi Godefroy en 1969, a pris en compte dès l’origine des dénombrements bactériens sur le lait de tank, à côté des critères de composition en matière grasse et en protéines : flore totale, puis spores butyriques. L’objectif était principalement d’ordre technologique. Il s’agissait d’encourager la production d’un lait dont le niveau de contamination bactérienne était suffisamment faible pour ne pas nuire aux transformations. Des critères de qualité sanitaires prenant en compte la recherche et les dénombrements de bactéries pathogènes, comme le staphylocoque doré ou Listeria monocytogenes, ont ensuite été introduits, notamment dans les régions de fabrications fromagères au lait cru.

Par ailleurs, le lait de tank est le support de nombreux diagnostics de maladies virales (rhinotrachéite infectieuse bovine [IBR], diarrhée virale bovine [BVD], pestiviroses, etc.), bactériennes (chlamydiose, fièvre Q, etc.) et parasitaires (fasciolose, ostertagiose, etc.) utilisant différentes techniques, notamment la PCR (poymerase chain reaction), l’Elisa directe et indirecte. Ces diagnostics réalisés sur le lait de tank pour dépister les troupeaux atteints par ces affections sont plus faciles à mettre en œuvre et moins coûteux que ceux pratiqués sur le sang individuel ou de mélange, même s’ils présentent leurs limites d’interprétation.

S’agissant des infections mammaires, leur diagnostic bactériologique s’effectue sur le lait de quartier. Évaluer l’importance relative des espèces en cause dans un troupeau requiert donc de réaliser un sondage bactériologique sur un échantillon de quartiers de taille suffisante, généralement de 15 à 20 [9]. Il est alors permis de se demander si, beaucoup plus simplement et à moindre coût, il est possible de réaliser des dénombrements microbiens sur le lait de tank pour analyser les infections mammaires qui prévalent dans un troupeau (photo).

ORIGINE DES BACTÉRIES PRÉSENTES DANS LE LAIT DE TANK

Les bactéries présentes dans le lait de tank ont deux origines possibles :

– une origine intramammaire, lorsqu’elles sont apportées par le lait de quartiers infectés ;

– une origine extramammaire, lorsqu’elles proviennent du corps de l’animal, particulièrement de la surface des trayons ou de son environnement.

Le nombre de bactéries dans le lait de tank provenant de l’une ou de l’autre origine varie dans de très grandes proportions selon l’espèce bactérienne considérée, ce qui amène, en première approche, à distinguer trois groupes.

1. Espèces ayant une origine essentiellement extramammaire

Il s’agit là des coliformes, de Pseudomonas sp. et des entérocoques. Leur nombre dans le lait de tank n’est pas corrélé, ou très faiblement, à la prévalence des infections mammaires dues à ces germes dans le troupeau. En revanche, leur dénombrement différentiel, distinguant notamment les bactéries thermorésistantes, psychrotrophes et coliformes, peut être utile pour préciser l’origine de la contamination environnementale du lait de tank [20]. Ainsi, un nombre élevé de bactéries coliformes qui résulte d’une multiplication microbienne à température ambiante est souvent dû à un défaut de conception ou de montage du matériel de traite ne permettant pas son nettoyage correct. Des mamelles sales peuvent aussi être en cause. Les bactéries thermorésistantes et psychrotrophes sont souvent le témoin de procédures insuffisantes (température, durée, turbulence) de nettoyage et de désinfection de la machine à traire. La concentration dans le lait de tank des bactéries psychrotrophes du genre Pseudomonas, qui sont les seules à pouvoir se multiplier aux températures de conservation du lait à la ferme (4 à 5 °C), a pu être reliée à un défaut de refroidissement du tank, à la saison (été) et encore à l’intervalle entre les collectes [15].

2. Espèces ubiquitaires

Il s’agit de Streptococcus uberis ou des staphylocoques coagulase-négatifs (SCN). En l’absence de possibilité de les distinguer selon leur origine, leur nombre dans le lait de tank ne peut guère être interprété en termes de prévalence d’infections mammaires dues à ces espèces ou d’identification de sources environnementales.

3. Espèces ayant une origine essentiellement intramammaire

La présence de Streptococcus agalactiae, des mycoplasmes et de Staphylococcus aureusdans le lait de tank est liée aux infections mammaires du troupeau [8, 13]. Les mammites dues à Str. agalactiae et aux mycoplasmes sont rares en France aujourd’hui. De plus, elles sont très contagieuses. L’objectif principal de leur recherche dans le lait de tank est alors de savoir si le troupeau en est indemne ou non :

– si oui, il s’agit de poursuivre les mesures de protection sanitaires visant à éviter l’entrée d’un animal infecté dans le cheptel ;

– si non, il convient de mettre rapidement en place des dispositifs de prévention et d’éradication spécifiques avant qu’un trop grand nombre d’animaux soient atteints.

S’agissant de S. aureus qui est à l’origine d’infections mammaires dans la plupart des élevages, l’objectif du dénombrement dans le lait de tank est d’évaluer la prévalence des infections dues à cette espèce dans le troupeau. Si elle est élevée, la prévention est orientée par les facteurs de risque spécifiques à ces infections : limitation des transferts d’agents pathogènes à l’occasion de la traite, prévention des lésions et des crevasses du corps du trayon, désinfection efficace des trayons après la traite. La mise en œuvre d’un plan de traitement adapté avec réforme des vaches incurables est également à l’ordre du jour [7, 19].

VARIATIONS DU NOMBRE DE BACTÉRIES D’ORIGINE MAMMAIRE DANS LE LAIT DE TANK

Le nombre des bactéries dans le lait de tank d’une espèce dont l’origine intramammaire est avérée ne dépend pas uniquement de la proportion des quartiers infectés par cet agent pathogène dans le troupeau. D’autres facteurs interviennent, dont les plus importants sont les suivants :

– le tri du lait consiste à écarter du tank celui des vaches à comptages cellulaires élevés, pour ne pas subir de pénalités. Il est pratiqué par de nombreux éleveurs. Dans ce cas, le lait de tank n’est pas représentatif de la production de la totalité du troupeau. Comme le lait écarté est précisément celui des vaches infectées, le biais engendré par cette pratique est important lorsque l’objectif est d’utiliser le dénombrement des bactéries dans le lait de tank pour évaluer la fréquence et la nature des infections mammaires présentes dans le troupeau ;

– le nombre de bactéries d’origine intramammaire dans le lait de tank varie sensiblement d’un jour à l’autre, alors que la prévalence des infections mammaires reste stable. Ce phénomène est expliqué par les fluctuations considérables observées dans l’excrétion des bactéries tout au long des infections. Ainsi, lors des mammites subcliniques à S. aureus, l’excrétion peut être intermittente, avec des dénombrements variant de zéro à plusieurs dizaines de milliers de bactéries par millilitre de lait de quartier à quelques jours d’intervalle. Ces fluctuations du nombre de bactéries présentent une amplitude supérieure à celles des cellules somatiques. Elles ne sont pas non plus synchrones avec ces dernières (tableau 1).

Dans les infections subcliniques à streptocoques, l’excrétion dans le lait est plus continue et généralement plus importante en moyenne, mais les amplitudes des variations quotidiennes sont comparables.

Le nombre de bactéries excrétées peut dépasser 10 millions par millilitre pendant et autour des épisodes cliniques, notamment lorsque les infections sont dues à des streptocoques ou à des coliformes. De telles variations du nombre de bactéries dans le lait des quartiers infectés se répercutent, de manière très atténuée, sur le lait de tank. Elles viennent contrarier l’interprétation des dénombrements bactériens pour évaluer la situation des troupeaux vis-à-vis des mammites. En pratique, la réalisation des dénombrements sur plusieurs prélèvements successifs permet de réduire cette variation parasite.

ÉVALUATION DE LA PRÉSENCE OU DE L’ABSENCE D’INFECTIONS MAMMAIRES RARES

La mise en évidence par analyse bactériologique de la présence de Str. agalactiae dans le lait de tank indique qu’au moins un quartier d’une vache dans le troupeau est infecté par cette espèce. L’interprétation est la même pour les mycoplasmes, sous réserve de l’identification d’une espèce impliquée dans les infections mammaires, comme Mycoplasma bovis. À l’inverse, un résultat négatif pour un agent pathogène ne donne pas l’assurance que le troupeau en est indemne : son excrétion dans le lait au moment du prélèvement est peut-être intermittente ou insuffisante. Le lait de la (ou des) vache(s) infectée(s) a aussi pu être écarté du tank.

La qualité du diagnostic peut être améliorée en répétant les prélèvements. Ainsi, dans le cadre d’une recherche de mycoplasmes, Gonzalez et Wilson recommandent de réaliser sept prélèvements quotidiens consécutifs [5]. En effet, si les résultats de culture de trois prélèvements de lait de tank réalisés à 3 ou 4 jours d’intervalle sont négatifs pour cet agent pathogène, la probabilité que les vaches collectées soient négatives est seulement de 70 %. Sept prélèvements de lait de tank sont également conseillés dans le cadre d’une recherche de Str. agalactiae [1].

Pour la recherche de Streptococcus agalactiae, la méthode bactériologique classique consiste à isoler les streptocoques sur un milieu gélosé sélectif du type TKT (thallium-crystal violet-toxin). La présence de l’espèce est ensuite confirmée par une identification complète à partir des colonies présentant les caractéristiques morphologiques correspondantes.

La mise en évidence de mycoplasmes, agents pathogènes à croissance lente, est plus fastidieuse. Elle nécessite un temps d’incubation de 5 à 10 jours sur un milieu de culture spécifique [6].

L’utilisation de la PCR, plus sensible que la bactériologie classique et procurant rapidement un résultat, paraît particulièrement adaptée à la recherche de Str. agalactiae et des mycoplasmes dans le lait de tank. Toutefois, cette haute sensibilité pourrait donner quelques résultats faux positifs, correspondant au passage de mycoplasmes respiratoires dans le lait, en l’absence d’infection mammaire. Une PCR spécifique de Mycoplasma bovis, comme celle qui est utilisée au Québec, permet d’affiner la recherche [3].

ÉVALUATION DE LA PRÉVALENCE DES INFECTIONS À STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Pour Gonzales et coll., une relation précise entre le dénombrement de colonies de S. aureus dans le lait de tank et le pourcentage d’animaux infectés dans le troupeau semble difficile à établir [4]. Il en est de même pour Jayarao et coll., même en se fondant sur quatre prélèvements sur une période de 2 semaines [10]. Dans ces conditions, l’usage de la bactériologie sur le lait de tank pour estimer de façon assez précise la prévalence des infections à staphylocoques dorés peut être contesté [14].

Les travaux menés en 1995 par l’Institut de l’élevage ont indiqué toutefois une relation entre le niveau de contamination du lait de troupeau (exprimé en unité logarithmique) et la prévalence des infections mammaires à staphylocoques coagulase-positifs(SCP). La liaison était très significative (p < 0,01), avec un pouvoir explicatif du modèle de régression de 63 % (figure) [11].

Des travaux plus récents ont montré une relation exponentielle entre les résultats d’une RT (real time)-PCR semi-quantitative sur des laits de tank reconstitués (exprimés en log du nombre de copies d’une séquence ADN caractéristique de S. aureus génotype B) et la prévalence simulée des infections mammaires dues à cette souche de staphylocoque doré [2]. La corrélation était très hautement significative (p < 0,001), avec un pouvoir explicatif du modèle de 86 %, étant entendu que le lait de tank reconstitué avec celui issu de vaches infectées ou non dans les proportions voulues présente une variabilité plus faible que des laits de tank réels.

La méthode bactériologique classique pour le dénombrement des SCP utilisant un milieu sélectif gélosé au plasma de lapin et au fibrinogène est celle qui est employée dans le cadre de la surveillance du lait cru (méthode ISO 6888-2 sous contrôle qualité Cecalait). Son coût unitaire est de l’ordre de 10 €. La RT-PCR peut permettre un dénombrement plus spécifique de l’espèce S. aureus et de souches particulières comme le génotype B à l’origine de pertes particulièrement lourdes, ou encore des souches porteuses du gène blaZ associé à la production de pénicillinases et à une efficacité réduite des traitements antibiotiques. Son coût est toutefois encore élevé.

Conclusion

Quelle que soit la méthode de mise en évidence ou de dénombrement utilisée (analyse bactériologique, comptage des colonies, PCR, RT-PCR, etc.), la liaison entre les bactéries présentes dans le lait de tank et les infections mammaires dans le troupeau n’est établie que pour les espèces dont l’origine est essentiellement intramammaire. Aucune conclusion n’est fondée concernant les espèces d’origine essentiellement environnementale ou ubiquitaires.

Parmi les bactéries provenant principalement de quartiers infectés, il convient de distinguer celles qui sont rarement en cause dans les infections mammaires mais qui sont très contagieuses, comme Str. agalactiae ou les mycoplasmes, et celles, comme S. aureus, à l’origine d’infections mammaires dans la plupart des élevages, mais à des niveaux de prévalence plus ou moins élevés.

Pour les premières, c’est surtout leur présence ou leur absence dans le lait de tank qui est recherchée, leur présence indiquant de manière quasi certaine l’existence d’au moins un quartier infecté dans le troupeau, et leur absence ne permettant pas de conclure, sauf si des analyses multiples se sont toutes révélées négatives, ou qu’une méthode à la fois très sensible et très spécifique, comme la PCR, a été utilisée.

S’agissant du nombre de staphylocoques dorés (ou de SCP) dans le lait de tank, sa liaison avec la prévalence des infections dans le troupeau n’apparaît pas très étroite au vu de la bibliographie. Elle paraît néanmoins suffisante pour distinguer quelques catégories d’élevages, notamment à faible ou à forte prévalence, sans avoir à mettre en œuvre une procédure lourde et coûteuse d’examens bactériologiques sur un échantillon représentatif de quartiers.

Bien que le recul manque encore sur l’interprétation des résultats de PCR et de RT-PCR pour le diagnostic des infections mammaires, notamment au regard des résultats faux positifs, l’utilisation de ces techniques sur le lait de tank pour évaluer la présence ou la prévalence d’infections mammaires dues aux quelques espèces d’origine intramammaire quasi exclusive semble prometteuse. Leurs qualités intrinsèques de sensibilité et de spécificité supérieures à celles de la bactériologie classique, la possibilité d’employer un conservateur et la rapidité du résultat pour la recherche de mycoplasmes devraient compenser un surcoût qui, pour un petit nombre d’analyses sur le lait de tank, paraît acceptable (encadré, tableaux 2 et 3).

Références

  • 1. Andersen HJ, Pedersen LH, Aarestrup FM, Chriél M. Evaluation of the surveillance programm of Streptococcus agalactiae in Danish dairy herds. J. Dairy Sci. 2003;86(4):1233-1239.
  • 2. Boss R, Naskova J, Steiner A, Graber HU. Mastitis diagnostics : Quantitative PCR for Staphylococcus aureus genotype B in bulk tank milk J. Dairy Sci. 2011;94:128-137.
  • 3. Francoz D. Les mycoplasmes, ces inconnus. Le producteur de lait québecois. Avril 2004:40-42. www.agrireseau.qc.ca/bovinslaitiers/documents/Veterinaire-Avril%202004.pdf
  • 4. Gonzalez RN, Jasper DE, Bushnell RB, Farver TB. Relationship between mastitis pathogen numbers in bulk tank milk and bovine udder infections in California dairy herds.J. Am. Vet. Med Assoc. 1986;189(4):442-445.
  • 5. Gonzalez RN, Wilson DJ. Mycoplasmal mastitis in dairy herds. Vet. Clin. North Am. Food. Anim. Pract. 2003;19(1):199-221.
  • 6. Gonzalez RN, Wilson DJ. Diagnosis of intramammary infections due to Mycoplasma bovis in dairy cattle.Proc. 3rd IDF International Mastitis Seminar, Book 1, Tel Aviv, Israel. 1995:23-27.
  • 7. Haenni M, Madec JY. Les méthodes de détection de la pénicilline G chez Staphylococcus spp. Bull. GTV. 2010;53:57-61.
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  • 9. Intervet, Filière blanche, SVGTV, UMT Maîtrise de la santé des troupeaux bovins. Référentiel pour l’utilisation de la bactériologie par le vétérinaire dans les interventions de maîtrise des mammites. 2011: 58p.
  • 10. Jayarao BM, Pillai SR, Sawant AA, Wolfgang DR, Hegde NV. Guidelines for monitoring bulk tank milk somatic cell and bacterial counts. J. Dairy Sci. 2004;87:3561-3573.
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  • 12. Neave FK. Diagnosis of mastitis by bacteriological methods alone. Proc. Seminar on Mastitis Control. FIL-IDF. 1975:19-36.
  • 13. Olde Riekerink RG, Barkema HW, Veenstra S, Poole DE, Dingwell RT, Keefe GP. Prevalence of contagious mastitis pathogens in bulk tank milk in Prince Edward Island. Can. Vet. J. 2006;47(6):567-572.
  • 14. Poutrel B. Prélever du lait pour rechercher Staphyloccus aureus. Point Vet. 2008;39(283):47-49.
  • 15. Raynaud S. Étude de la contamination du lait par les bactéries coliformes en Bretagne. Institut de l’élevage et GIE Lait-Viande Bretagne. 2005:85p.
  • 16. Rysanek D, Zouharova M, Babak V. Monitoring major mastitis pathogens at the population level based on examination of bulk tank milk samples. J. Dairy Res. 2009;76(1):117-123.
  • 17. Salat O. Gestion des mammites à S. aureus en élevage. Point Vét. 2008;39(282):43-50.
  • 18. Sérieys F, Bidaud O, Frasson J, Bonnier M. Utilisation de la bactériologie par le vétérinaire pour la maîtrise des mammites : élaboration d’une méthodologie et test en élevage. J. Nat. GTV Nantes. 2009:651-661.
  • 19. Sérieys F., Gicquel-Bruneau M. Homogénéité intratroupeau des souches de Staphylococcus aureus de mammites subcliniques pour la production de bêta-lactamases et la résistance à la pénicilline. Renc. Rech. Rumin. 2005;12:267-270.
  • 20. Wallace RL. Bacteria counts in raw milk. 2008. http://www.livestocktrail.illinois.edu/uploads/dairynet/papers/Bacteria%20Counts%20in%20Raw%20Milk%20DD%202008.pdf

REMERCIEMENTS

à Daniel Le Clainche (GDS 56) et à Hervé Quintin (BCEL-Ouest) pour la fourniture des comptages cellulaires.

Points forts

→ Les analyses bactériologiques sur le lait de tank permettent de mettre en évidence la présence d’infections mammaires peu fréquentes à Str. agalactiae et à mycoplasmes.

→ Les dénombrements de staphylocoques dorés sur le lait de tank apportent pour un coût modique une indication sur la prévalence des infections dues à cette espèce dans le troupeau.

→ Le tri du lait par l’éleveur fait qu’un prélèvement sur tank n’est pas représentatif du lait produit par la totalité du troupeau.

→ Le nombre de bactéries d’origine intramammaire dans le lait de tank varie sensiblement d’un jour à l’autre, alors que la prévalence des infections mammaires reste stable.

→ La proposition de réaliser des analyses individuelles n’est que peu suivie.

ENCADRÉ
Une application sur le terrain dans le Morbihan

→ Une application a été conduite dans le Morbihan, à l’initiative du Comité départemental de développement de l’élevage. L’objectif était de classer les élevages laitiers selon leur niveau de prévalence des infections à staphylocoques coagulase-positifs (SCP), en vue d’y conduire des actions de maîtrise différenciées.

Pour cela, l’équation établie par l’Institut de l’élevage a été utilisée et quatre groupes d’élevages ont été constitués avec des priorités d’action différentes (tableau 2).

→ Après une première mise en œuvre dans les années 2000 dans une trentaine d’élevages en suivi par le contrôle laitier, cette action a connu un développement en 2011 avec la proposition d’un appui individualisé comprenant systématiquement deux comptages de SCP sur lait de tank à 3 semaines d’intervalle, en plus de l’approche classique. Les producteurs ont pu également bénéficier d’une aide pour la réalisation d’analyses bactériologiques sur le lait de quartier, selon un protocole s’inspirant des recommandations de Salat et de Sérieys et coll. et validé par les organismes techniques du département [17, 18].

→ Un total de 83 producteurs, dont 23 en contrat de suivi “hors normes”, c’est-à-dire ayant livré un lait contenant plus de 400 000 cellules/ml en moyenne géométrique trimestrielle lors de deux trimestres consécutifs, se sont engagés dans cette action.

L’absence de lien entre la classe de numération de SCP et les résultats de comptages cellulaires sur le lait de tank confirme les observations antérieures (tableau 3) [10, 16]. Elle s’explique par la forte contribution à la concentration cellulaire du lait de tank des infections dues à des espèces autres que S. aureus, notamment à Str. uberis, dont la prévalence en Bretagne et en France est élevée.

Le dénombrement bactérien et celui des cellules somatiques dans le lait de tank doivent être considérés comme des indicateurs complémentaires à signification épidémiologique différente.

→ Pour les 45 producteurs qui avaient des dénombrements de SCP très faibles, ces analyses ont conduit à écarter l’hypothèse d’une forte prévalence de S. aureus dans les quartiers infectés, donc à s’orienter vers d’autres pistes.

→ La proposition de réaliser des analyses individuelles n’a été que très peu suivie. Seuls neuf élevages en ont effectué, dont quatre présentaient des nombres élevés de SCP dans leur lait de tank. La lourdeur de ces protocoles semble être le principal frein, tant pour les conseillers et vétérinaires que pour les éleveurs. Pareil constat conduit à envisager une démarche en deux étapes : des analyses sur le lait de tank pour un premier screening, les analyses individuelles ne se justifiant ensuite que dans les élevages où une forte prévalence de S. aureus est suspectée.

→ Ce programme va se poursuivre dans le département du Morbihan, en ciblant spécifiquement les cheptels présentant une moyenne géométrique trimestrielle de comptages cellulaires sur le lait de tank supérieure à 400 000 cellules/ml.

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