Méthodes de diagnostic des orbivirus des ruminants

Les virus de la fièvre catarrhale ovine (virus FCO ou blue tongue virus) et de la maladie hémorragique des cervidés (ou epizootic hemorrhagic disease of deer virus – EHDV) appartiennent à la famille des Reoviridæ et au genre Orbivirus [⁵, ⁹]. Ces deux virus présentent des similarités très importantes sur les plans structural, antigénique, moléculaire, mais aussi dans leur mode de transmission (par des piqûres de moucherons de type Culicoides), leur spectre d’hôtes (les ruminants) et la pathogénie (encadrés 1 et 2).

DIAGNOSTIC DE LABORATOIRE

1. Techniques de diagnostic

Compte tenu de la similarité des signes cliniques induits par les deux virus (notamment dans les régions où ils cocirculent), le diagnostic de laboratoire est la plupart du temps indispensable pour confirmer la suspicion clinique. Les méthodologies utilisées à cette fin sont identiques, toujours en raison de la parenté antigénique et moléculaire des deux Orbivirus, même si elles sont plus développées pour le diagnostic de la fièvre catarrhale ovine.

L’émergence de la FCO en Europe puis en France (en Corse en 2000 et sur le continent en 2006) a largement contribué au développement des techniques de diagnostic sérologique et moléculaire, et plus particulièrement celui dit « de type » ou de génotypage (tableau 1 complémentaire sur www.WK-Vet.fr).

Différentes techniques de diagnostic peuvent être mises en place au cours de l’infection par ces virus (^{tableaux 2} et ³).

2. Cas de la fièvre catarrhale ovine

Après plusieurs années de circulation virale et de vaccination, le diagnostic repose essentiellement sur la PCR. Les techniques sérologiques Elisa détectent des anticorps post-infectieux et/ou postvaccinaux pendant plusieurs mois et n’identifient donc pas un cas récent.

En France, il existe deux laboratoires nationaux de référence (LNR) pour le diagnostic de la FCO : le Cirad-IEMVT (Centre de coopération internationale en recherche agronomique pour le développement – Institut d’élevage et de médecine vétérinaire des pays tropicaux) pour la sérologie et le laboratoire de santé animale de l’Anses (Agence nationale de sécurité sanitaire, ex-Afssa, Agence française de sécurité sanitaire des aliments) pour la virologie et la biologie moléculaire.

3. Cas de la maladie hémorragique des cervidés

Si l’EHD était introduite en France, le diagnostic de laboratoire serait dans un premier temps la réaction en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction ou PCR), suivie d’un isolement viral (indispensable au diagnostic de certitude). Le diagnostic sérologique pourrait ensuite être utilisé à plus grande échelle. Le cheptel étant indemne, la séroconversion permet de confirmer une suspicion clinique. Actuellement, seul le laboratoire de santé animale de l’Anses est en mesure de réaliser le diagnostic de l’EHDV.

DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

À la suite de la piqûre d’un Culicoidesinfecté, le virus, après multiplication initiale dans les nœuds lymphatiques, est transporté dans l’organisme par le sang. Il est alors étroitement lié aux hématies où il est retrouvé dans des invaginations de la membrane. À ce stade, le virus ou une partie de son génome peut alors être détecté.

1. Génome

La détection du génome viral dans le sang (prélevé sur EDTA exclusivement) peut être réalisée par des techniques d’amplification génomique (reverse transcriptase-polymerase chain reaction ou RT-PCR). Les expérimentations animales effectuées avec plusieurs sérotypes du virus FCO ont montré que le génome peut être découvert dès le deuxième jour postinfection et cela pendant plusieurs mois (notamment pour ce qui concerne les bovins).

Il existe aujourd’hui des trousses commerciales validées pour détecter tous les génotypes de FCO (excepté les sérotypes 25 et 26) (sociétés AES et LSI) ou d’EHDV (LSI). Elles s’appuient sur l’amplification de segments d’ARN codant pour des protéines communes à l’ensemble des sérotypes de chacun des deux virus (telles les protéines VP7 ou VP1). D’autres kits, qui reposent sur l’amplification du segment d’ARN codant la protéine VP2 qui est, elle, spécifique du sérotype viral, permettent l’identification du/des sérotypes présents dans l’échantillon. Actuellement, ces techniques spécifiques du type viral ne sont développées que pour les sérotypes de FCO qui ont circulé dans le bassin méditerranéen (BTV-1, -2, -4, -6, -8, -9, -16). Ces méthodes de RT-PCR en temps réel autorisent théoriquement une estimation de la charge virale. L’unité de mesure est le CT (threshold-cycle ou cycle seuil). La valeur du CT (entre 1 et 40) est inversement proportionnelle à la charge virale. Un prélèvement d’une valeur de CT de 17 est considéré comme très fortement chargé en virus alors qu’un CT de 35 lui vaut le statut de faible positif.

Ce genre de technique permet, en quelques heures, la détection du génome viral. Cependant, la présence d’ARN viral dans l’échantillon n’indique pas nécessairement celle de virus infectieux, et donc que les signes cliniques éventuellement observés sont dus aux virus. L’ARN du virus FCO est retrouvé très longtemps après rémission complète de l’animal. Les ARN doubles brins du virus sont ainsi découverts par RT-PCR sur des sangs de veaux infectés 90 jours après que le virus ne peut plus être isolé au laboratoire [⁴]. Les résultats doivent donc être interprétés avec précaution.

2. Virus

Le sang sur EDTA qui présente des résultats positifs en RT-PCR avec une charge virale suffisamment élevée (CT < 33) est inoculé à des œufs embryonnés de 9 à 11 jours. Les œufs sont incubés dans une couveuse à 33°C et mirés chaque jour. Le virus, présent dans le prélèvement, se multiplie et provoque une mort de l’embryon entre 2 et 7 jours postinoculation. Les œufs sont alors ouverts et des lésions hémorragiques plus ou moins importantes selon les sérotypes et les souches sont observées sur les embryons (^{photos 2a} et ^2b). La présence du virus peut alors être confirmée par RT-PCR ou par inoculation des embryons homogénéisés à des cellules de mammifères (BHK 21 issues de rein de hamster ou Vero provenant de rein de singe vert africain) ou cellules d’insectes (C6/36, cellules d’Aedes albopictus). La réplication du virus dans les cellules de mammifères se traduit par l’apparition d’un effet cytopathique après incubation des cellules à 37°C (^{photos 3a} et ^3b). Le virus ainsi isolé peut être identifié par RT-PCR ou par neutralisation virale.

Le diagnostic par isolement viral ne permet pas de réaliser un diagnostic d’urgence car le délai de réponse est de 15 jours au minimum et peut s’étendre jusqu’à 1 mois selon le nombre de passages réalisés pour isoler le virus.

DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE

1. Diagnostic de groupe par Elisa

Dès le 6^e jour postinfection et pendant plusieurs mois, des anticorps peuvent être détectés dans le sérum des animaux à l’aide de trousses commerciales de type Elisa. Ces kits sont utilisés pour un diagnostic de groupe (ils reposent sur la détection des anticorps dirigés contre la protéine VP7, antigènes communs aux 24 sérotypes de la FCO). Une trousse commerciale de même type vient d’être commercialisée pour la détection des anticorps EHDV. Dans les régions où les cheptels ovins et bovins sont vaccinés contre la FCO, la séropositivité peut être attribuée à la détection d’anticorps postvaccinaux. Ce type de diagnostic n’est donc utilisable à grande échelle que sur des populations non vaccinées. Actuellement, aucun test n’autorise à distinguer les anticorps post-vaccinaux (induits par la vaccination avec un vaccin inactivé) des anticorps postinfectieux.

2. Séroneutralisation

Dans le même temps, la séroneutralisation sur culture de cellules Vero ou BHK 21 peut être utilisée pour déterminer l’identité du ou des sérotypes vis-à-vis desquels sont dirigés les anticorps. Cette technique permet de mettre en évidence les anticorps lancés contre la protéine spécifique de type VP2. Sa réalisation est cependant très lourde et l’interprétation reste délicate en raison des nombreuses réactions croisées entre les sérotypes. Elle n’est actuellement mise en place que par les LNR.

APPLICATIONS PRATIQUES

1. Identification des sérotypes circulant dans les DOM-TOM

En 2006, à la suite de l’importation en Martinique d’une trentaine de bovins en provenance de France, des -prélèvements de sang ont été réalisés tous les 10 jours pendant 1 mois. Au bout de 1 mois, 80 % des animaux ont présenté des PCR FCO positives et 56 % ont montré une séroconversion (Elisa positif). Les animaux ne présentent alors aucun signe clinique. Après inoculation des échantillons aux œufs embryonnés et passage sur cellules, 13 souches FCO ont pu être isolées. Aucune des techniques de PCR de type disponibles à cette époque n’a permis d’identifier le sérotype des souches. Une méthodologie associant l’amplification génique et la détermination de la séquence nucléotidique du segment d’ARN 2, spécifique du type viral, a été développée. La comparaison de la séquence nucléotidique, même partielle de ce segment, avec les séquences homologues présentes dans les banques de données internationales telles que GenBank⁽¹⁾ permet de déterminer le sérotype (encadré 3 complémentaire sur www.WK-Vet.fr). De cette façon, les sérotypes 2, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 22, et 24 ont pu être identifiés lors de cette étude, et plus récemment le sérotype 11 en Martinique et les sérotypes 5, 3 et 17 en Guadeloupe.

2. Épizootie de maladie hémorragique des cervidés à la Réunion

Au mois de janvier 2009, des bovins élevés sur l’île de la Réunion ont présenté des signes cliniques évocateurs de la FCO. Des analyses par amplification génique (RT-PCR) réalisées sur les prélèvements sanguins de 116 bovins présents dans différentes communes de l’île ont permis de détecter la présence du génome du virus de la maladie hémorragique des cervidés sur 106 échantillons et, sur 5 d’entre eux, la présence concomitante du virus de la FCO. Sept souches d’EHDV et 1 souche du virus de la FCO ont été isolées sur œufs embryonnés puis sur culture de cellules BHK 21. La souche FCO de sérotype 2 a été identifiée par neutralisation virale sur culture de cellules. Pour les souches d’EHDV, aucun outil de diagnostic de type n’était disponible.

La comparaison des séquences nucléotidiques des segments 2 des différents sérotypes de l’EHDV présents dans GenBank a permis de les associer en quatre groupes en fonction de leur homologie de séquences (^{figure 2}). Dans chaque groupe, a été sélectionné et validé un couple d’amorces qui permet l’amplification spécifique des sérotypes du groupe. Des PCR utilisant ces quatre couples d’amorces ont été réalisées sur les ARN extraits des sept souches EHDV. Un produit d’amplification a été obtenu uniquement avec les amorces du groupe C (EHDV 6 et EHDV 8). Les séquences nucléotidiques des produits d’amplification ont été déterminées (Cogenics) et leur analyse à l’aide du logiciel Blast 2.2.21 (NCBI) a permis d’établir leur appartenance au sérotype 6.

Conclusion

Même si les techniques de diagnostic de laboratoire sont bien développées pour le diagnostic de première intention, il reste beaucoup à faire quant au diagnostic du type viral (mise au point de méthodes de RT-PCR en temps réel pour l’identification de chaque sérotype, production d’antisérum de référence pour les virus EHDV). C’est aussi le cas pour le diagnostic sérologique différentiel animaux vaccinés/animaux infectés. La caractérisation du génome des souches virales qui circulent est indispensable. Dans ce cadre, l’analyse des séquences nucléotidiques constitue une aide précieuse pour le suivi épidémiologique des souches (évolution spatio-temporelle de la circulation virale et surveillance de l’apparition de nouvelles mutations). Les mutations ponctuelles sur le génome peuvent, par exemple, impliquer la non-reconnaissance d’une souche par les techniques de PCR (faux négatifs).

Références

• 1. Breard E, Sailleau C, Hamblin C et coll. Outbreak of epizootic haemorrhagic disease on the island of Réunion. Vet. Rec. 2004 ; 155(14): 422-423.
• 2. Bréard E, Sailleau C, Viarouge C et coll. Maladie hémorragique du cerf : une menace ? Point Vét. 2010 ; 306 : 11.
• 3. EFSA. Scientific opinion on epizootic hemorrhagic disease. EFSA Journal . 2009 ; 7(12): 1418.
• 4. MacLachlan NJ, Nunamaker RA, Katz JB et coll. Detection of bluetongue virus in the blood of inoculated calves : comparison of virus isolation, PCR assay, and in vitro feeding of Culicoides variipennis. Arch. Virol . 1994 ; 136(1-2): 1-8.
• 5. Maclachlan NJ, Osburn BI. Epizootic haemorrhagic disease of deer. In : Infectious diseases of livestock. 2004 ; 2 : 1227-1230
• 6. Padiolleau S. Les vaches en bavent de la maladie hémorragique épizootique à La Réunion. Semaine Vétérinaire. 2009 ; 1346 : 23.
• 7. Roy P. Bluetongue virus proteins and particles and their role in virus entry, assembly, and release. Adv. Virus Res. 2005 ; 64 : 69-123.
• 8. Sailleau C, Bréard E, Viarouge C et coll. Cocirculation des virus de la maladie hémorragique des cervidés et de la fièvre catarrhale ovine à la Réunion en 2009. Epidémiologie et santé animale. 2010 ; 5 : 21-29.
• 9. Verwoerd D, Erasmus BJ. Bluetongue. In : Infectious diseases of livestock. 2nd ed. Cape Town, Oxford University Press. 2004 : 1201-1220.