Etape 1 : Les analyses biochimiques : éviter les erreurs (1)

En dehors de l’animal luimême, de nombreux facteurs influencent le résultat d’une analyse biologique : tout ce qui se passe avant (lors de la phase dite préanalytique), pendant (phase analytique) et après l’analyse (phase postanalytique, figure 1). Avec l’essor des automates de laboratoire qui équipent les structures vétérinaires, le praticien devient le seul responsable de la qualité de ses résultats d’analyse. Il lui faut connaître les principales sources d’erreurs pour pouvoir les détecter, les corriger et les prévenir : c’est l’assurance qualité.

FACTEURS PRÉANALYTIQUES

Les facteurs préanalytiques regroupent tout ce qui a lieu avant l’analyse et qui peut influencer son résultat. Ces facteurs sont liés soit à l’animal (statut physiologique ou pathologique, traitement en cours, prise du dernier repas, etc.), soit à l’obtention du spécimen (technique de prélèvement, choix et identification des tubes, traitement de l’échantillon, etc.). Ils sont responsables de la majorité des erreurs commises, en médecine vétérinaire comme en médecine humaine. Une étape préalable, correspondant au choix raisonné des analyses dans le contexte du cas étudié (commémoratifs, anamnèse, interrogatoire, examen clinique), conditionne considérablement l’interprétation des résultats. Appelée phase pré-préanalytique, elle est primordiale car, outre le coût financier pour le propriétaire généré par la réalisation d’analyses inutiles, elle peut aboutir à des erreurs diagnostiques, motivant d’autres investigations et retardant la prise en charge de l’animal.

1.Facteurs liés à l’obtention du spécimen

Une analyse biochimique a pour but de mesurer la concentration d’un analyte (c’est-à-dire une substance chimique) dans un liquide biologique. Les conditions du prélèvement varient selon les analytes.

Site de ponction et technique de prélèvement

Une fois les analyses choisies, il convient de s’interroger sur la nature et la localisation du spécimen à prélever. La plupart des analyses biochimiques courantes sont réalisables à partir d’une ponction veineuse périphérique. La localisation de la ponction (veine jugulaire ou céphalique) et la taille de l’aiguille (21 ou 23 G par exemple) sont généralement déterminées par le gabarit de l’animal. Le recours à une aiguille trop fine peut fragiliser les hématies et entraîner une hémolyse, faussant certains résultats (voir plus bas). Par exemple, la mesure de la fructosamine est fortement impactée par l’hémolyse : des valeurs très élevées sont observées, souvent au-delà de la gamme de mesures.

Une ponction traumatique peut entraîner des microlésions musculaires qui augmentent certaines activités enzymatiques, créatine kinase et transaminases (Asat) notamment, de façon artefactuelle.

Le prélèvement de sang artériel est parfois indispensable (mesure de la pression partielle en oxygène, par exemple). Une seringue contenant de l’héparine lyophilisée est idéale pour ce type de prélèvement dont l’analyse doit être immédiate afin d’éviter les échanges gazeux avec l’air ambiant.

Du sang capillaire peut également être utilisé pour certaines analyses réalisées au chevet de l’animal avec des dispositifs embarqués, comme un glucomètre.

Choix du tube et préparation du spécimen

Pour la plupart des analyses biochimiques de routine, l’héparine (sous la forme d’héparine de lithium) est l’anticoagulant de choix. Le sang hépariné doit être centrifugé (5 à 10 minutes de 1 000 à 2 000 g ⁽¹⁾) rapidement après le prélèvement, afin d’obtenir un plasma non hémolysé. L’hémolyse, et plus généralement la coloration anormale du plasma/ sérum, est une cause fréquente d’erreur analytique, car la plupart des automates de biochimie utilisent la photométrie (absorbance ou réflectance) comme méthode analytique (^{photo 1}). L’utilisation d’autres anticoagulants n’est pas recommandée pour la réalisation des analyses biochimiques courantes. D’une part, les dosages ne sont généralement pas validés en dehors de l’héparine, et d’autre part, certaines analyses sont massivement faussées. C’est le cas avec l’acide éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA), qui complexe tous les ions divalents (Ca2+, Fe2+, Mg2+, Zn2+, etc.), rendant impossible la mesure de leur concentration. De plus, l’EDTA est généralement associé au potassium dans les tubes (EDTA dipotassique ou tripotassique), ce qui entraîne systématiquement des hyperkaliémies artefactuelles très élevées (supérieures à 9 mmol/l).

Des anticoagulants spécifiques peuvent se révéler nécessaires pour réaliser certaines analyses différées, notamment lorsqu’elles sont externalisées (voir plus bas). Le flurorure inhibe la glycolyse (mesure du glucose et des lactates) et l’aprotinine, mélangée à l’EDTA, possède une activité antiprotéolytique, par exemple pour la mesure de l’hormone corticotrope (ACTH) et de la parathormone (PTH). Dans tous les cas, l’homogénéisation du prélèvement doit être effectuée avant l’analyse, avec précaution, par lents retournements successifs du tube, afin d’éviter un phénomène d’hémolyse ou de coagulation, préjudiciable à l’analyse. Le sérum, obtenu après la coagulation (formation du caillot en 1 à 2 heures au minimum) et la centrifugation du sang total conservé dans un tube sec, et le plasma peuvent être utilisés indifféremment pour la majorité des analyses biochimiques [⁴]. Il existe néanmoins quelques exceptions à connaître :

- l’électrophorèse des protéines s’effectue sur le sérum. En effet, le fibrinogène présent dans le plasma (absent du sérum car utilisé lors de la coagulation) migre dans la région des bêta-gamma globulines, ce qui modifie leur interprétation ;

- il est préférable de mesurer la kaliémie sur le plasma hépariné, préparé rapidement après le prélèvement. En effet, une sortie du potassium des cellules (hématies, plaquettes en cas de thrombocytose marquée) est possible et peut augmenter la kaliémie de façon artefactuelle, notamment chez certaines races de chiens (shiba et akita inu).

L’effet des activateurs de coagulation, parfois contenus dans les tubes (sous la forme de billes qui sont des microparticules de silice) ou les gels de séparation, est mal connu en biologie vétérinaire.

Pour les autres dosages (immunologiques par exemple), les recommandations du laboratoire sont à respecter afin d’utiliser un spécimen pour lequel l’analyse est validée. Pour la biochimie urinaire, en l’absence d’inflammation du tractus urinaire, le rapport protéinurie/créatininurie (RPCU) peut être mesuré indifféremment sur des prélèvements par cystocentèse ou par miction spontanée, collectés et conservés dans un tube en plastique ou en verre, sans additif [², ⁸, ⁹]. Dès lors qu’elle n’engendre pas de coloration macroscopique, l’hématurie (microscopique ou réaction péroxydase positive à la bandelette) ne modifie pas le résultat du RPCU [⁶].

Identification et stockage des prélèvements (stabilité)

Les tubes doivent être identifiés (noms du propriétaire et de l’animal, date) afin d’éviter toute inversion, notamment si l’analyse est effectuée par une personne différente de celle qui a prélevé ou si elle est externalisée. Si toutes les étapes décrites précédemment ont été respectées, la plupart des analytes biochimiques sont stables plusieurs heures à température ambiante, plusieurs jours à 4 °C et plusieurs semaines à - 20 °C. Les analytes tels que l’ammonium ou les gaz du sang sont à analyser immédiatement après leur collecte, en raison des échanges gazeux qui peuvent modifier leur concentration. Comme évoqué plus haut, certaines hormones peptidiques (ACTH, PTH par exemple) sont rapidement dégradées par protéolyse (en quelques heures) et obligent à une congélation pour garantir leur stabilité sur plusieurs jours. Toutefois, le cycle congélation/ décongélation/recongélation est souvent plus délétère que la conservation courte (inférieure à 24 heures) à température ambiante ou entre 4 et 6 °C. Ainsi, la plupart des laboratoires préfèrent recevoir un spécimen non congelé au préalable.

2. Facteurs liés à l’animal

Statut physiologique et pathologique

Certaines maladies (ictère, hyperlipémie lors d’obésité ou d’endocrinopathie) peuvent être à l’origine d’une coloration anormale du plasma susceptible de modifier les résultats. Selon les cas, l’analyse peut être réitérée ultérieurement. Il est aussi envisageable de s’affranchir de ces modifications artefactuelles : lors d’hyperlipémie par exemple, la solution consiste à allonger la période de jeûne ou à conserver le prélèvement 24 heures à + 4 °C, puis à retirer la couche lipidique avant la centrifugation.

Certaines hormones, comme celles du système rénine-angiotensinealdostérone ou la thyroxine (T4), ont un rythme de sécrétion circadien et pulsatile largement méconnu chez le chien et le chat. En pratique, plusieurs mesures au cours de la journée peuvent faciliter l’interprétation de ces variations physiologiques.

Le stress émotionnel, particulièrement marqué chez le chat, entraîne une sécrétion de catécholamines et de cortisol à l’origine d’une hyperglycémie. Aucun seuil de glycémie ne permet de discriminer une hyperglycémie physiologique de stress d’un diabète sucré [¹]. Selon les signes cliniques, le vétérinaire peut avoir recours à d’autres tests, souvent discriminants (glucosurie, fructosamines).

Diète et prise alimentaire

Une diète alimentaire d’au moins 8 heures est recommandée avant la réalisation d’un prélèvement en vue d’une analyse biochimique. En effet, la prise d’un repas provoque une augmentation significative de certains analytes pendant plusieurs heures :

- une hyperglycémie est observée durant les deux à trois heures postprandiales, associée à des pics de sécrétion d’insuline ;

- la concentration sanguine en créatinine et en urée s’accroît, ce qui interfère cependant rarement avec les seuils de la décision clinique ;

- une lipémie postprandiale (hypercholestérolémie, hypertriglycéridémie), souvent constatée, induit une turbidité plasmatique susceptible d’interférer avec les techniques de dosage par colorimétrie ;

- des hausses transitoires de la trypsin-like immunoreactivity (TLI) et de la pancreatic lipase immunoreactivity (PLI) sanguines sont également notées [⁵].

Traitements

La chlorémie est impossible à mesurer avec une électrode spécifique lorsque l’animal reçoit du bromure, car l’anion bromure (Br-) et l’anion chlorure (Cl-) sont indifféremment mesurés par cette technique.

Une tranquillisation à l’aide d’α2- agonistes a un effet hyperglycémiant, plus marqué avec la xylazine qu’avec la médétomidine [¹]. L’activité des enzymes hépatiques - surtout les phosphatases alcalines (PAL), voire, dans une moindre mesure, les transaminases (Alat) et les gamma-glutamyltranspeptidases (γGT) - augmente chez les chiens qui reçoivent des stéroïdes (corticoïdes inclus) ou du phénobarbital.

En pratique, il est important de documenter toute intervention iatrogène pour l’interprétation des résultats.

ERREURS ANALYTIQUES

1. Sources d’erreurs

La qualité analytique des tests mis sur le marché est normalement garantie par les fabricants. L’utilisation de machines développées et optimisées pour la pratique vétérinaire, qui automatisent l’ensemble du dosage (calibration, pipetage, dilution, ajout de réactif, incubation, lecture, etc.), réduit fortement les risques d’erreurs analytiques. De plus, ces automates intègrent des systèmes de contrôle permettant de repérer de grosses erreurs de fonctionnement (température, volume insuffisant, parfois qualité préanalytique, etc.).

Toutefois, la fiabilité d’un test est garantie pour son usage dans des conditions idéales d’utilisation. Or la plupart des erreurs analytiques sont liées à l’utilisateur et au non-respect des procédures : préparation des spécimens, conservation des réactifs (température, date de péremption), maintenance de l’automate (nettoyage extérieur et intérieur, remplacement des pièces usagées, mise à jour du logiciel).

Il est primordial d’assurer la formation de l’ensemble des utilisateurs (rédaction de procédures écrites) et de dédier l’entretien des machines à certaines personnes.

Repérer rapidement les erreurs analytiques est indispensable car, contrairement aux erreurs préanalytiques qui ne concernent que le spécimen analysé, elles sont susceptibles de fausser les résultats de toutes les analyses effectuées tant que le problème persiste.

2. Contrôle qualité

Plusieurs résultats d’analyse discordants avec la situation clinique doivent faire suspecter des erreurs analytiques, mais leur mise en évidence peut être très tardive. La mise en place d’outils adaptés à la détection précoce et systématique de ces erreurs est donc primordiale.

C’est l’objectif du contrôle qualité, qui comprend un contrôle qualité interne, réalisé au sein de la structure qui utilise l’automate, et une évaluation externe, effectuée par un organisme indépendant et plutôt réservée aux laboratoires spécialisés. La mise en place d’un contrôle qualité interne pour les automates de biologie médicale est recommandée dans tous les établissements de soins vétérinaires [⁷]. Il consiste en la réalisation d’analyses à partir d’un matériel de contrôle (généralement une solution à reconstituer à partir d’un lyophilisat), issu d’un fournisseur indépendant ou du fabricant de l’automate, et dont la concentration est connue (^{photos 2a} et ^2b). Le résultat obtenu avec l’automate est comparé à un intervalle cible de concentration prédéterminé. Cet intervalle est calculé pour que la probabilité de détecter une erreur analytique soit de 85 à 90 %, tout en limitant le risque de rejeter faussement le résultat du contrôle à 5 % (c’est-à-dire de conclure à une erreur analytique alors qu’elle n’existe pas).

Lorsqu’un contrôle est faux, donc que le résultat obtenu sort de l’intervalle, il convient : - de vérifier le matériel de contrôle et les réactifs (préparation, stockage, date de péremption) ;

- de recommencer la maintenance de l’appareil (nettoyage complet, redémarrage) ;

- de réitérer le contrôle ;

- de contacter l’assistance technique si le problème persiste malgré ces mesures.

La fréquence idéale des contrôles varie selon l’analyse et l’automate. Elle dépend du volume d’analyses réalisées et des performances de chaque technique. Pour les analyseurs de paillasse, la fréquence préconisée est hebdomadaire (recommandations internationales) ou mensuelle (recommandations des constructeurs) [⁷].

En outre, plusieurs contrôles consécutifs étant effectués avec le même matériel, donc avec le même lot, il est possible de reporter les valeurs obtenues au cours du temps sur un graphique (^{figure 2}). Cela permet une évaluation rétrospective pour détecter les erreurs. Des règles statistiques peuvent aussi être appliquées [³].

L’implémentation du contrôle qualité représente un coût généralement accessible (une centaine d’euros par an pour un contrôle mensuel, hors techniques immunologiques), l’objectif étant de limiter le nombre de contrôles tout en maximisant les chances de repérer les erreurs analytiques.

3. Les erreurs postanalytiques

Il s’agit d’erreurs de retranscription des résultats dans le dossier de l’animal, d’unités absentes ou fausses (^{figure 3}). Certains automates ne rendent pas de résultat lorsque la valeur obtenue est en dehors de la gamme analytique, ce qui pose des problèmes d’interprétation.

Le stockage durable et sécurisé de l’information est important et peut s’appuyer sur un logiciel de gestion de cabinet vétérinaire fiable.

L’interprétation des résultats des analyses, selon le contexte anamnestique et clinique, fait également partie de l’étape postanalytique (phase post-postanalytique).

4. Cas particulier des analyses externalisées

Pour certaines analyses, le praticien peut avoir recours à des laboratoires de biologie vétérinaire spécialisés. Des erreurs sont également possibles tout au long du processus et peuvent être limitées par la mise en place de bonnes pratiques.

La phase préanalytique est l’étape critique, car le laboratoire qui reçoit les prélèvements est dépendant des informations transmises par le vétérinaire prescripteur. Le respect des conditions d’envoi est en outre impératif (type de spécimen, tube de transport, délai d’acheminement), ainsi que l’identification précise du matériel envoyé.

Concernant l’étape analytique, elle est peu sujette à des erreurs compte tenu des systèmes de contrôle qualité mis en place. Toutefois, aucune technique n’étant infaillible, la prise en compte du contexte anamnestique et clinique, à condition qu’il soit renseigné, pourra aider le laboratoire à mettre en évidence un résultat aberrant.

Conclusion

Les sources d’erreurs qui peuvent altérer la fiabilité du résultat d’une analyse biochimique sont nombreuses. En pratique, la phase préanalytique est cruciale et responsable de la majorité des erreurs. La phase analytique peut être contrôlée efficacement par la mise en place et le suivi d’un contrôle qualité interne. Enfin, la qualité de la phase postanalytique est améliorée par l’informatisation et la mise en place d’une communication directe entre les différents logiciels de la clinique.

• 1. 1^re partie.

• (1) La force appliquée s’exprime en g, la conversion en tours par minute dépend du diamètre de la centrifugeuse.

Références

• 1. Ambrisko TD, Hikasa Y. Neurohormonal and metabolic effects of medetomidine compared with xylazine in beagle dogs. Can. J. Vet. Res. 2002;66:42.49.
• 2. Beatrice L, Nizi F, Callegari D et coll. Comparison of urine protein-to-creatinine ratio in urine samples collected by cystocentesis versus free catch in dogs. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2010;236:1221.1224.
• 3. Carroll TA, Pinnick HA, Carroll WE. Probability and the Westgard rules. Ann. Clin. Lab. Sci. 2003;33:113.114.
• 4. Cerón JJ, Martinez- Subiela S, Henneman C et coll. The effects of different anticoagulants on routine canine plasma biochemistry. Vet. J. 2004;167:294.301.
• 5. James FE, Mansfield CS, Steiner JM et coll. Pancreatic response in healthy dogs fed diets of various fat compositions. Am. J. Vet. Res. 2009;70:614.618.
• 6. Jillings E, Squires R, Azarpeykan S et coll. Does blood contamination of urine compromise interpretation of the urine protein to creatinine ratio in dogs? N. Z. Vet. J. 2019;67:74.78.
• 7. Newman AW, Behling- Kelly E. Quality assurance and quality control in point-ofcare testing. Top. Companion Anim. Med. 2016;31:2.10.
• 8. Théron ML, Piane L, Lucarelli L et coll. Effects of storage conditions on results for quantitative and qualitative evaluation of proteins in canine urine. Am. J. Vet. Res. 2017;78:990.999.
• 9. Vilhena HCR, Santos RR, Sargo TJ et coll. Urine proteinto- creatinine concentration ratio in samples collected by means of cystocentesis versus manual compression in cats. J. Am. Vet. Med. Assoc. 2015;246:862-867.