Idées reçues en chirurgie oncologique

Le cancer est une des causes majeures de mortalité chez le chien et le chat. C’est aussi une maladie chronique qui peut être prise en charge. Même si le traitement n’est pas toujours in fine curatif, il doit permettre une amélioration de la qualité de vie. Choisir le protocole thérapeutique approprié requiert une bonne connaissance du comportement biologique de la tumeur et des options de traitement. Celles-ci peuvent intégrer plusieurs disciplines, comme l’oncologie médicale, la chirurgie ou la radiothérapie. Afin de maximiser les bénéfices du traitement et les chances de guérison, les vétérinaires doivent s’appuyer sur des publications scientifiques. Les discussions avec des praticiens ou des étudiants révèlent le profond ancrage de quelques idées reçues, véhiculées à l’heure actuelle comme de véritables “bien-fondés” de la chirurgie oncologique vétérinaire. Cet article a pour objectif de clarifier certaines incompréhensions ou idées préconçues.

IDÉE REÇUE N° 1

1. Énoncé

« La biopsie n’augmente pas le risque de dissémination de cellules tumorales. »

2. Réalité

La biopsie (prélèvement d’un échantillon du tissu cible) fournit des informations essentielles et souvent décisives pour le diagnostic (lésion néoplasique versus non néoplasique, bénigne versus maligne, grade), les options thérapeutiques (planification de l’acte chirurgical, traitements adjuvants) et le pronostic (palliatif versus curatif).

En excluant la biopsie excisionnelle, trois types de prélèvement sont décrits :

– le prélèvement à l’aiguille fine ou cytoponction pour l’analyse cytologique ;

– la biopsie à l’aiguille Tru-cut pour l’analyse cytologique ou histologique ;

– la biopsie incisionnelle (incluant la biopsie “punch” ou “en coin”) pour l’analyse histologique. Cette dernière est préférable (particulièrement lors de tumeurs friables, inflammatoires ou nécrotiques) car un traitement chirurgical ciblé ne peut être choisi sans diagnostic histologique préalable.

Une biopsie préopératoire est indiquée quand les résultats de l’analyse de cette procédure vont affecter :

– les options thérapeutiques (chimiothérapie adjuvante à l’acte chirurgical lors de mastocytome de grade III ou de mélanome malin cutané) ;

– l’étendue de la résection chirurgicale (1 cm pour des mastocytomes de grade I ou un histiocytome bénin versus 3 cm pour des mastocytomes de grade III ou des sarcomes des tissus mous) ;

– la volonté du propriétaire de traiter (chimiothérapie recommandée lors d’ostéosarcome osseux primaire en complément du geste chirurgical, alors que les thérapies adjuvantes sont généralement non requises en cas de fibrosarcome osseux primaire) [⁸, ³⁷].

Contrairement aux idées reçues, la biopsie est susceptible d’élever le risque de métastases. Une incision dans un néoplasme malin peut favoriser la contamination des tissus adjacents, augmentant ainsi le risque de récidive locale [¹²]. Dans une étude récente, une corrélation positive est identifiée entre la réalisation d’une cytoponction préopératoire sur des sarcomes des tissus mous et le risque de récidive locale [²]. La même constatation est notée lors de carcinomes urogénitaux chez le chien [²⁷]. Cela peut être expliqué par les hémorragies générées sur le trajet de l’aiguille, favorisant l’implantation et la dissémination de cellules tumorales à travers les différents plans musculaires et fascia(s), bien que les sarcomes présentent habituellement une faible vascularisation.

3. Synthèse

Les cytoponctions à l’aiguille fine et les biopsies incisionnelles (“en coin” ou au “punch”) doivent être réalisées selon des règles précises afin de limiter le risque de métastases et de ne pas compromettre l’exérèse chirurgicale ultérieure (encadrés 1 et 2). À la condition de respecter ces bonnes pratiques chirurgicales, la valeur des informations fournies par la biopsie excède largement les aspects potentiellement négatifs de la procédure. Une biopsie reste toujours préférable à une exérèse chirurgicale initiale en aveugle.

IDÉE REÇUE N° 2

1. Énoncé

« Le recours à une solution d’irrigation hypotonique réduit le taux de récidives locales après une excision chirurgicale marginale. »

2. Réalité

Une étude sur 74 chiens après une résection chirurgicale incomplète d’un mastocytome cutané montre que le groupe traité par irrigation de la zone de résection avec de l’eau distillée (solution hypotonique) présente significativement moins de récidives locales (31,6 %), comparé au groupe pour lequel seul le retrait a été réalisé (63,6 %) [¹³]. Néanmoins, des résultats contradictoires sont rapportés [¹⁷]. Dans un essai prospectif récent, contrôlé et randomisé en double aveugle, 30 chiens opérés d’un mastocytome cutané unique ont été traités volontairement avec des marges de résection de 0,5 cm [³]. Le lit sous-cutané a été ensuite irrigué en fin de procédure soit avec une solution isotonique de lactate de Ringer (groupe contrôle), soit avec une solution hypotonique d’eau distillée. Tous les cas inclus sont des mastocytomes de stade 0 (absence d’atteinte du nœud lymphatique de drainage) et de grade II. Aucune différence significative sur le taux de récidives locales n’est observée entre les deux groupes.

3. Synthèse

Comment prendre position face aux résultats conflictuels de ces études ? Jusqu’à cet essai prospectif de 2008, tous les travaux contenaient des variables non randomisées pouvant influencer les résultats (grades histologiques et stades cliniques différents, tumeurs complètement ou incomplètement réséquées). À l’heure de l’evidence based medicine (médecine fondée sur les faits prouvés), les études prospectives contrôlées randomisées en double aveugle constituent le niveau de validité scientifique le plus élevé, derrière les méta-analyses [¹⁸]. L’interprétation des résultats et le crédit scientifique doivent donc prendre en compte le modèle de conception de l’étude. Cependant, même si le taux de récidives locales n’est pas affecté par l’utilisation de soluté, l’irrigation régulière de la zone opératoire prévient l’assèchement des tissus qui exacerbe la réaction inflammatoire et augmente le risque d’infection.

IDÉE REÇUE N° 3

1. Énoncé

« Le retrait du nœud lymphatique de drainage est un traitement de la maladie métastatique. »

2. Réalité

Une controverse importante entoure la question du retrait du nœud lymphatique de drainage (ou sentinelle [NLS]) lors de l’excision d’une masse cutanée ou sous-cutanée. L’adage courant énonçant que « l’excision du NLS tumorisé permet le retrait des métastases et augmente la durée de survie » souffre néanmoins de l’absence de validation scientifique en médecine tant humaine que vétérinaire. Cette recommandation est née initialement des travaux de Halsted au XIX^e siècle (encadré 3) [¹⁴].

L’exemple le plus représentatif est celui des carcinomes des sacs anaux (CSA) chez le chien. Plus de 50 % des chiens atteints d’un CSA présentent des métastases dans les nœuds lymphatiques iliaques médiaux (improprement appelés “sous-lombaires”) [³¹]. Ces derniers constituent le site préférentiel de métastases. L’excision chirurgicale de la tumeur anale primitive est considérée comme le traitement de choix. Cependant, certains chirurgiens recommandent en complément la résection des métastases régionales (lymphadénectomie iliaque). Une étude rétrospective portant sur 32 chiens atteints d’un CSA n’a démontré aucune différence dans les médianes de survie avec ou sans excision du NLS [³¹]. Dans une autre série de cas, 5 des 3 chiens avec des métastases aux NL iliaques médiaux et traités par une exérèse locale du sac anal associée à une lymphadénectomie iliaque présentent une médiane de survie de 20,6 mois, suggérant ainsi un possible effet bénéfique d’une chirurgie adjuvante métastatique [¹⁶]. Dans l’attente d’une étude prospective à plus grande échelle, son bénéfice reste cependant incertain.

Le concept de Halsted ne reflète en effet pas le réel comportement biologique des tumeurs (sans relation à un type histologique précis). Il est vrai que les tumeurs épithéliales métastasent préférentiellement par voie lymphatique et les tumeurs mésenchymateuses plutôt par voie sanguine. Cependant, malgré des voies de dissémination préférentielles, les tumeurs métastasent par ces deux voies simultanément [¹⁵]. Par conséquent, le retrait du NLS augmente l’agressivité de l’acte chirurgical sans traiter nécessairement la maladie métastatique. Est-ce à dire néanmoins que l’évaluation du NLS ou son retrait est obsolète ?

3. Synthèse

La biopsie du NLS doit faire partie intégrante de la démarche oncologique diagnostique lors de néoplasme malin. La cytoponction à l’aiguille fine est, en général, suffisante, mais une biopsie incisionnelle ou excisionnelle peut être nécessaire. Le statut du NLS évalue l’extension du processus tumoral, oriente ou non vers la mise en place d’une chimiothérapie postopératoire adjuvante, et précise le pronostic [⁴, ⁶, ¹⁹, ²³]. Cependant, l’absence de métastases histologiques n’exclut pas une maladie métastatique [⁴, ³⁶]. Les micrométastases ne sont en effet pas détectées à l’examen histologique conventionnel et nécessitent le recours à des techniques d’immunohistochimie, longues et onéreuses [²⁸].

IDÉE REÇUE N° 4

1. Énoncé

« L’obtention de marges “saines” sur la pièce d’exérèse exclut tout risque de récidive et la présence de cellules tumorales rend la récidive obligatoire. »

2. Réalité

Quatre types de résection oncologique sont distingués, selon que celle-ci est :

– intracapsulaire ou intralésionnelle, correspondant à une excision macroscopiquement incomplète de la tumeur, peu utilisée en raison de la rapidité de la récidive ;

– marginale, avec une excision incomplète de la tumeur (persistance de cellules tumorales microscopiques) lors de marges de résection inférieures à celles qui sont recommandées (2 cm pour un sarcome des tissus mous). Les récidives sont fréquentes, nécessitant une réintervention chirurgicale ou une radiothérapie adjuvante (^{photos 2a}, ^2b et ³) ;

– large, recommandée en chirurgie oncologique. Elle permet l’excision de la partie visible de la tumeur et des cellules tumorales microscopiques au pourtour de celle-ci (^{photo 4}). Pour les tumeurs cutanées et sous-cutanées, cette résection s’établit sur la base de recommandations usuelles dépendant du type histologique et du grade (cas des mastocytomes) (^tableau). Un guide précis n’est cependant pas disponible pour tous les types histologiques. La taille de la lésion semble également influencer l’extension tumorale microscopique, laquelle est d’autant plus importante que la tumeur est volumineuse ;

– radicale, équivalant au retrait de la structure anatomique ou du compartiment qui contient la tumeur (mastectomie unilatérale ou bilatérale lors de masses mammaires, amputation d’un membre thoracique ou pelvien lors de fibrosarcome cutané ou osseux) (^{photo 5}). La récidive est peu fréquente [⁷, ²⁸].

Le pathologiste examine sur la pièce d’exérèse les marges de section (périphériques et en profondeur) pour vérifier la présence ou non de cellules néoplasiques et leur distance des marges saines. Cette évaluation quantitative des marges de section aide à planifier la dose chirurgicale en cas de réintervention ou à définir le volume cible lors de radiothérapie externe adjuvante.

Le placement de repères (fils de suture ou agrafes) sur la pièce d’exérèse pour orienter la masse (retranscrits sur le rapport d’histopathologie) et in situ est un élément fondamental pour assister le travail du pathologiste et/ou planifier une éventuelle reprise chirurgicale.

Le risque de récidive locale n’est pas complètement éliminé par l’absence de cellules tumorales sur les marges de section car :

– le pathologiste n’examine qu’un échantillon des marges de section ;

– les micrométastases ne sont pas détectées en histologie conventionnelle et requièrent l’utilisation d’immunomarquages [²⁸].

3. Synthèse

La présence de marges “larges” doit donc être interprétée avec prudence et ne peut constituer une raison valable à l’absence de thérapies adjuvantes. Un mastocytome de grade II ou III, même avec des marges “larges”, nécessite la mise en place d’une radiothérapie et/ou d’une chimiothérapie adjuvante [²²].

À l’inverse, la détection de cellules tumorales aux marges de section n’apparaît pas nécessairement associée à une récidive [²]. Le volume tumoral peut, en effet, être trop faible pour engendrer une rechute. Une reprise chirurgicale ou une radiothérapie adjuvante doivent cependant être conseillées afin de limiter une récidive locale. L’analyse des marges de section n’est donc pas le seul facteur impliqué dans la survenue d’une récidive locale des tumeurs cutanées et sous-cutanées. La rechute locale doit être considérée comme un phénomène multifactoriel dépendant plus du comportement biologique de la tumeur (agressivité locale ou à distance) et du volume tumoral résiduel que du type d’excision. Ces résultats ne doivent pas néanmoins être surinterprétés et l’exérèse large demeure l’objectif en chirurgie oncologique. Mieux vaut laisser une plaie ouverte que des cellules tumorales.

IDÉE REÇUE N° 5

1. Énoncé

« Le traitement des tumeurs mammaires repose uniquement sur une mastectomie régionale ou totale. »

2. Réalité Différencier la chienne et la chatte

Les tumeurs mammaires (TM) sont les néoplasmes les plus fréquents chez la chienne. Elles représentent 42 % de l’ensemble des tumeurs dans cette espèce et 82 % de celles de l’appareil génital [⁵, ²⁶]. Elles se situent au troisième rang des tumeurs chez la chatte, derrière le lymphome et les lésions cutanées [³⁰].

Le traitement de choix des TM dans ces deux espèces est l’excision chirurgicale en l’absence de métastases avérées. Les modalités de résection incluent la nodulectomie, la mastectomie simple, la mastectomie régionale, la mastectomie totale unilatérale et la mastectomie bilatérale [²³].

La technique chirurgicale est choisie en fonction de l’espèce (chien ou chat), de la taille de la tumeur, du nombre de glandes affectées, de la localisation de la masse, de ses adhérences aux tissus sous-jacents et du statut clinique de l’animal. La prévalence élevée des tumeurs mammaires malignes chez la chatte (80 %) justifie pleinement une résection radicale (mastectomie totale unilatérale ou bilatérale) en première intention. À l’inverse, chez la chienne, seulement 50 % des tumeurs mammaires sont malignes [³⁰]. Une mastectomie simple peut donc être envisagée en première intention dans l’attente des résultats histologiques. En cas de confirmation de la nature maligne de la tumeur, une mastectomie régionale ou totale associée à une chimiothérapie est à envisager dans un second temps. La plupart des études suggèrent, en effet, que, chez la chienne, la méthode de retrait n’influence pas le pronostic pour autant que les marges de résection soient microscopiquement saines [²³, ²⁴, ³³]. L’effet bénéfique en termes de récidive locale et d’amélioration de la médiane de survie n’est pas démontré lors de mastectomie radicale [¹⁰].

Intérêt de l’ovariectomie

Chez la chienne, l’effet protecteur de l’ovariectomie et la présence de récepteurs aux hormones stéroïdiennes dans le tissu mammaire indiquent que des facteurs hormonaux sont impliqués dans le développement de ces néoplasmes. Les œstrogènes (E) et la progestérone (P) endogènes jouent un rôle central dans l’étiologie des TM. Leurs récepteurs (REs et RPs) sont présents dans 50 % des TM malignes et 70 % des TM bénignes [²³]. Les tumeurs qui ne comportent pas de récepteurs hormonaux sont plus agressives et moins différenciées que celles qui les expriment [³²].

Une ovario-hystérectomie précoce pratiquée avant le premier œstrus, voire avant le second, a un effet avéré sur l’incidence ultérieure des TM chez la chienne. Le risque de développement de TM est de 0,5 % avant le premier œstrus, de 8 % avant le second et de 26 % pour les femelles stérilisées après le second cycle. Passé ce délai, l’effet protecteur de la stérilisation est minimal, bien que le risque de développer des TM bénignes est encore réduit [²¹, ³⁴]. Deux études rapportent que l’ovariectomie réalisée lors du retrait des TM améliore significativement la médiane de survie lors de TM bénignes et malignes [²⁴, ³⁵]. Les chiennes stérilisées 2 ans auparavant ou lors du retrait des TM ont une médiane de survie de 45 % supérieure à celle des chiennes non stérilisées [³⁵]. Pour d’autres, la réalisation d’une ovariectomie n’a pas d’influence sur le pronostic de survie ou le taux de récidive [²⁵, ³⁸]. Cependant, dans ces dernières études, aucune distinction n’a été faite entre les tumeurs riches et pauvres en récepteurs hormonaux. Or 70 % des tumeurs bénignes et 50 % des carcinomes présentent des récepteurs hormonaux, qui peuvent prévenir le risque de récidives [²³, ³³].

L’intérêt d’une stérilisation conjointement à l’exérèse du tissu mammaire tumoral n’est pas démontré pour l’heure chez la chatte [²¹].

3. Synthèse

Si la mastectomie totale unilatérale ou bilatérale constitue le traitement de choix des tumeurs mammaires chez la chatte, la mastectomie simple peut être envisagée en première intention chez la chienne dans l’attente des résultats histologiques. L’intérêt d’une stérilisation reste également d’actualité dans la gestion des TM chez la chienne. Si l’ovariectomie ou l’ovario-hystérectomie est réalisée durant le même temps opératoire, elle doit l’être avant le retrait des TM pour prévenir une dissémination tumorale au sein de la cavité abdominale. En plus de son effet préventif sur la croissance des TM, la stérilisation permet de supprimer les risques inhérents à l’apparition d’autres affections du tractus urogénital femelle (lactation de pseudogestation, métrite).

Conclusion

Une connaissance précise des règles de chirurgie oncologique est nécessaire pour tirer le meilleur bénéfice de l’acte chirurgical. La réévaluation régulière des “idées reçues” est fondamentale viales nouvelles publications scientifiques ou les modifications d’opinions d’experts. Des règles présentées autrefois comme de véritables “bien-fondés” ou vérités acquises sont ainsi remises en question. La reconnaissance de ces évidences et le développement de nouvelles techniques amènent à prodiguer la meilleure qualité de soins aux animaux cancéreux.

Références

• 1. Aldair F. Long-term follow-up of breast cancer patients. The 30 year report. Cancer. 1974;33(4):1145-1150.
• 2. Bacon NJ, Dernell WS, Ehrart N and coll. Evaluation of primary reexcision after recent inadequat resection of soft tissue sarcomas in dogs : 41 cases (1999-2004). J. Am. Vet. Med. Assoc. 2007;230(4):548-554.
• 3. Brocks BAW, Neyens IJS, Teske E et coll. Hypotonic water as adjuvant therapy for incompletely resected canine mast cell tumors : A randomized, double-blind, placebo-controlled study. Vet. Surg. 2008;37(5):472-478.
• 4. Cohen AM. Adjuvant therapy for colorectal cancer. Curr. Probl. Cancer. 1998;22:5.
• 5. Cotchin F. Further observations on neoplasias in dogs with particular reference to site of origin and malignancy. Br. Vet. J. 1954;110:218.
• 6. Crawshaw J. Prognosis for dogs with nonlymphomatous small intestinal tumors treated by surgical excision. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 1998;34(6):451-456.
• 7. Dernell WS, Withrow SJ. Preoperative patient planning and margin evaluation. Clin. Tech. Small Anim. Pract. 1998;13(1):17-21.
• 8. Ehrhart N. Principles of tumor biopsy. Clin. Tech. Small Anim. Pract. 1998;13(1):10-16.
• 9. Enneking WF, Maale GE. The effect of inadvertant tumor contamination of wounds during the surgical resection of musculoskeletal neoplasms. Cancer. 1998;62:1251.
• 10. Fergurson RH. Canine mammary gland tumors. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 1985;15(3):501–511.
• 11. Gilson SD, Stone EA. Principles of oncologic surgery. Compend. Contin. Educ. Pract. Vet. 1990;12:827-838.
• 12. Gilson SD, Stone EA. Surgically induced tumor seeding in 8 dogs and 2 cats. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1990;196(11):1811-1815.
• 13. Grier RL, Di Guardo G, Myers R et coll. Mast cell tumor destruction in dogs by hypotonic solution. J. Small Anim. Pract. 1995;36(9):385-388.
• 14. Halsted W. The results of operations for cancer of the breast performed at John’s Hopkins Hospital. John Hopkins Hosp. Bull. 1894;4:497.
• 15. Harris JR. Cancer of the breast. In: De Vita DT et coll., eds. Cancer: Principles and practice of oncology. 4^th ed. JB Lippincott, Philadelphia. 1993:1264.
• 16. Hobson HP, Brown MR, Rogers K. Surgery of metastatic anal sac adenocarcinoma in five dogs. Vet. Surg. 2006;35(3):267-270.
• 17. Jaffe MH, Hosgood G, Kerwin SC et coll. Deionised water as an adjunct to surgery for the treatment of canine cutaneous mast cell tumors. J. Small Anim. Pract. 2000;41:7-11.
• 18. Innes JH. Outcome-based medicine in veterinary surgery : levels of evidence. Vet. Surg. 2008;36:610-612.
• 19. Kurzman ID, Gilbertson SR. Prognostic factors in canine mammary tumors. Semin. Vet. Med. Surg. 1986;1(1):25-32.
• 20. Liptak JM. The principles of surgical oncology : surgery and multimodality therapy. CompendiumVet.com. 2009.
• 21. Martin de Las Mulas J, Van Niel M, Millan Y et coll. Progesterone receptors in normal, dysplastic and tumourous féline mammary glands. Comparison with oestrogen receptors status. Res. Vet. Sci.2002;72:153-161.
• 22. McEntee MC. Principles of adjunct radiotherapy and chemotherapy. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 1995;25(1):133-148.
• 23. McEwen EG, Harvey HJ, Patnaik AK et coll. Evaluation of effects of levamisole and surgery on canine mammary cancer. J. Biol. Resp. Mod. 1985;4(4):418-426.
• 24. Misdorp W. Canine mammary tumours : protective effect of late ovariectomy and stimulating effect of progestins. Vet. Quart. 1988;10(1):26-33.
• 25. Morris JS, Diobson JM, Bostock DE et coll. Effect of ovariohysterectomy in bitches with mammary neoplasms. Vet. Rec. 1998;142(24):656-658.
• 26. Moulton JE. Tumors of the mammary gland. In: Moulton JE, ed. Tumours in domestic animals. 3^rd ed. University of California Press, Berkeley. 1990:518-552.
• 27. Nyland TG, Wallack ST, Wisner ER. Needle-tract implantation following US-guided fine-needle aspiration of transitional cell carcinoma of the bladder, urethra, and prostate. Vet. Radiol. Ultrasound. 2002;43(1):50-53.
• 28. O’Brien MG. Skin and subcutis. In: Slatter DH. 3^rd ed. Textbook of small animal surgery. WB Saunders, Philadelphia. 2003:2367-2459.
• 29. Powers BE. The pathology of neoplasia. In: Withrow SJ, McEwen EG, eds. Small animal clinical oncology. 3^rd ed. WB Saunders, Philadelphia. 2001:4-17.
• 30. Robbins M. Reproductive oncology. In: Slatter DH. 3^rd ed. Textbook of small animal surgery. WB Saunders, Philadelphia. 2003:2437-2444.
• 31. Roos JT, Scavelli TD., Matthiesen DT et coll. Adenocarcinoma of the apocrine glands of the anal sacs in the dog : a review of 32 cases. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 1991;27:349-355.
• 32. Rutteman GR, Misdorp W. Hormonal background of canine and feline mammary tumours. J. Reprod. Fertil. 1993;47(Suppl.):483-487.
• 33. Sartin EA, Barnes S, Kwapien RP et coll. Estrogen and progesterone receptor status of canine mammary carcinomas and correlation with clinical outcome. Am. J. Vet. Res. 1992;53(11):2196-2200.
• 34. Schneider R, Dorn CR, Taylor DO. Factors influencing canine mammary cancer development and postsurgical survival. J. Natl. Cancer Inst. 1969;43(6):1249-1261.
• 35. Sorenmo KU, Shofer FS, Goldschmidt MH. Effect of spaying and timing of spaying on survival of dogs with mammary carcinoma. J. Vet. Intern. Med. 2000;14(3):266-270.
• 36. Valagusa P. Patterns of relapse and survival following radical mastectomy : analysis of 716 consecutive patients. Cancer. 1978;41(3):1170-1178.
• 37. Withrow SJ. Biopsy principles. In: Withrow SJ, McEwen EG, eds. Small animal clinical oncology. 3^rd ed. WB Saunders, Philadelphia. 2001:63-69.
• 38. Yamagami T, Kobayashi T, Takahashi K et coll. Influence of ovariectomy at the time of mastectomy on the prognosis for canine malignant mammary tumours. J. Small Anim. Pract. 1996;37(10):462-464.