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ENDOCRINOLOGIE ET BIOLOGIE CLINIQUE
Moderniser l’endocrinologie clinique
Auteur(s) : Benoît Rannou
Fonctions : VetAgro Sup
Campus vétérinaire de Lyon,
laboratoire de biologie médicale
1, avenue Bourgelat
69280 Marcy-l’Étoile
Les dosages hormonaux présentent des particularités à connaître pour réaliser l’analyse correctement et interpréter le résultat avec discernement.
Le diagnostic et le suivi des maladies endocriniennes reposent sur les données cliniques recueillies par le praticien, mais également sur les résultats de dosages hormonaux. Alors qu’il y a quelques années, ces dosages ne pouvaient être réalisés qu’au laboratoire, plusieurs hormones peuvent maintenant être mesurées par des petits automates au sein des cliniques(1).
Les hormones étant présentes en très faible concentration dans le sang, leur mesure est fondée sur une reconnaissance antigène-anticorps. Ce recours à un dosage immunologique entraîne des particularités techniques qui doivent être prises en compte lors de la réalisation et de l’interprétation d’un test endocrinologique.
Les hormones sont présentes à de très faibles concentrations dans le sang (10-9 à 10-12?mol/l, soit un million de fois moins que la plupart des substrats biochimiques classiques (en 10-3 mol/l) ce qui nécessite des détecteurs puissants d’où l’utilisation de techniques immunologiques pour les doser [1, 3].
Le principe de ces techniques consiste à fixer l’hormone dont la concentration doit être déterminée par ses anticorps spécifiques (mono- ou polyclonaux).
En endocrinologie, deux techniques immunologiques peuvent être distinguées : le dosage immunométrique (ou direct) et le dosage par compétition (ou indirect).
La principale technique utilisée pour le dosage immunométrique direct est la méthode « sandwich » : la totalité de l’hormone à doser se lie à un premier anticorps fixé en excès sur un support. La présence de l’hormone est ensuite révélée par un second anticorps marqué. L’intensité du marquage augmente proportionnellement avec la concentration de l’hormone à doser (figures 1 et 2).
Pour les dosages par compétition, l’hormone à mesurer est mise en compétition avec une hormone homologue marquée dans un milieu contenant leur anticorps en quantité limitée et connue.
La totalité des sites d’anticorps disponibles étant liée à la fin de l’incubation, la fraction est inversement proportionnelle à la concentration en hormone à doser (figures 3 et 4). C’est ce type de dosage qui est utilisé le plus couramment en endocrinologie.
Les systèmes de révélation sont utilisés pour mettre en évidence et mesurer la quantité d’anticorps ou d’analogues hormonaux marqués en fin de réaction. Les systèmes sont différenciés selon le marqueur utilisé : radioactivité, enzymologie, fluorescence et chimiluminescence.
Suivant la façon dont a été effectué l’immunodosage, il est question :
- d’immunoradiometric assay (IRMA), s’il est réalisé par immunométrie ;
- de radio-immuno assay (RIA), s’il est fait par compétition.
Lors de technique utilisant la radioactivité, les anticorps et les traceurs sont marqués avec un élément radioactif, le plus souvent de l’iode125. Les rayonnements émis sont quantifiés par un compteur γ [3]. En raison de l’utilisation de matériel radioactif, elle ne peut être réalisée que dans des laboratoires agréés par l’Autorité de sureté nucléaire.
C’est la technique de référence utilisée par les laboratoires de biologie médicale vétérinaire universitaires. Elle permet des mesures précises de faibles concentrations et le dosage de très nombreuses hormones, et n’est pas ou peu influencée par l’utilisation d’anticoagulants, l’hémolyse ou la lipémie [4]. Elle est cependant de moins en moins utilisée par les laboratoires en raison des contraintes réglementaires, des risques pour le personnel technique découlant de la manipulation de matériel radioactif, et de la disparition progressive des trousses commerciales utilisables (encadré 1). En effet, d’autres techniques n’utilisant pas ce matériel sont maintenant disponibles en médecine vétérinaire.
La chimiluminescence est à présent la technique la plus répandue sur les automates d’endocrinologie des laboratoires spécialisés [2]. Elle n’est pas encore disponible sur les automates disponibles dans les cliniques vétérinaires.
Les molécules sont marquées avec une enzyme activant un substrat qui émet de la lumière pendant un court laps de temps. Ce type de dosage présente l’avantage d’émettre un signal puissant, mais manque de précision, puisqu’il dépend de l’activité enzymatique.
Lors d’immunoenzymologie, il est question de techniques enzyme labelled immunoabsorbent assa y (Elisa) ou enzymo-immuno assay (EIA) selon l’immunodosage réalisé (respectivement par immunométrie ou compétition) [1].
Dans ces techniques, les anticorps ou les traceurs sont couplés avec une enzyme (peroxydase, phosphatase alcaline ou b-galactosidase le plus fréquemment) qui produit la coloration d’un substrat (encadré 2). La sensibilité est moins bonne que pour la radioactivité ou la chimiluminescence. Dans d’autres techniques, le substrat catalysé produit une fluorescence ce qui augmente la sensibilité du test (intéressant pour des faibles concentrations en hormone).
Quels que soient l’immunodosage et le système de révélation utilisés, un signal est produit (couleur, lumière, ou radioactivité). Il est proportionnel (dans le cas de l’immunométrie) ou inversement proportionnel (dans le cas du dosage par compétition) à la concentration en l’hormone dosée.
Ce signal est comparé à celui qui est obtenu à partir d’une courbe de référence (ou courbe standard) produite à partir de cinq ou de six échantillons étalons (dont la concentration pour chacun d’eux est connue). Cela permet d’en déduire la concentration en hormone dans l’échantillon.
Les conditions préanalytiques correspondent à toutes les étapes précédant le dosage en lui-même (choix du tube, préparation de l’animal, envoi du prélèvement notamment). Ces conditions peuvent modifier le résultat et sont à prendre en compte particulièrement dans l’interprétation d’un dosage endocrinologique.
Par défaut, un tube ne contenant aucun additif pour le dosage de la plupart des hormones est souvent préférable (tube sec), en raison du recours à un dosage immunologique [4]. En effet, certains anticoagulants peuvent interférer avec l’immunodosage ou le système de révélation. Par exemple, l’héparine, molécule de grande taille, peut interférer avec la reconnaissance antigène-anticorps.
De même, les systèmes de révélation colorimétrique font souvent appel à des enzymes utilisant comme cofacteurs des ions divalents qui peuvent être chélatés en cas d’utilisation d’un tube contenant de l’acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) ou du citrate. Toutefois, pour certaines hormones peptidiques particulièrement fragiles comme la PTH et l’ACTH, il est recommandé d’utiliser des tubes contenant de l’EDTA qui inhibe l’effet de protéases contenues dans le plasma. Certains auteurs proposent aussi de rajouter de l’aprotinine (Trasylol®(2)), qui a également une action antiprotéolytique [4].
L’effet de la présence d’activateurs de coagulation dans le tube sec n’a pas été montré en médecine vétérinaire. En médecine humaine, une étude n’a pas mis en évidence des différences significatives entre les concentrations en T4 totale et le cortisol, mesurées sur différents types de tubes secs (avec ou sans activateurs de coagulation). Le sang avait été prélevé chez des patients en bonne santé [2].
Dans tous les cas, il est indispensable de respecter les recommandations du laboratoire ou du distributeur des kits de dosage pour les automates de cliniques.
L’hémolyse colore le sérum (ou le plasma) et la lipémie le rend trouble. Elles peuvent interférer avec les systèmes de révélation par colorimétrie, spectrophotométrie ou chimiluminescence, surtout si elles sont marquées (encadré 3). La RIA est moins voire peu influencée par l’hémolyse ou la lipémie.
La prise de sang doit être réalisée, si possible, chez un animal à jeun et calme (photo 2) [4]. D’un point de vue technique, il est recommandé de noter toute anomalie de la couleur ou de la turbidité du prélèvement avant le dosage afin de pouvoir en tenir compte lors de l’interprétation du résultat.
La spécificité d’un dosage correspond à sa capacité à ne doser que la molécule recherchée. Ce point est particulièrement important en endocrinologie, car les techniques de dosage sont fondées sur une reconnaissance antigène-anticorps. Deux éléments interviennent particulièrement dans cette reconnaissance antigène-anticorps : l’effet matrice et la spécificité antigénique.
L’effet matrice peut se définir comme la complexité du milieu dans lequel l’hormone est dosée, c’est-à-dire l’ensemble des molécules du sérum ou du plasma [4]. Il existe en effet de nombreuses molécules dans ce milieu, pouvant interférer avec le dosage, à des degrés divers et inconnus. Le sérum ou le plasma contiennent notamment des protéines de transport et de l’inflammation qui peuvent avoir une affinité plus ou moins grande pour l’anticorps utilisé dans le dosage de l’hormone. La quantité et l’affinité pour l’anticorps varient suivant le statut physiologique de l’animal, mais surtout, suivant l’espèce.
Ainsi une trousse de dosage validée dans une espèce ne l’est pas forcément pour une autre.
Pour être utilisables, les trousses de dosage doivent disposer d’anticorps capables de reconnaître l’hormone à doser. Le fait qu’une trousse de dosage validée pour une espèce puisse être, ou non, utilisable pour une espèce et pas pour une autre, dépend du choix de l’anticorps et de la plus ou moins grande communauté de la structure de l’hormone entre les différentes espèces. Cela est particulièrement valable pour les hormones peptidiques (TSH, insuline, PTH, prolactine, par exemple).
Cette spécificité antigénique peut aussi présenter l’avantage de différencier des hormones endogènes de celles provenant de sécrétions tumorales (molécules hormonales différentes selon qu’elles sont sécrétées par la glande ou la tumeur). C’est par exemple le cas de la PTH, dont les anticorps de la trousse de dosage ne reconnaissent pas la PTHrP sécrétée notamment par les adénocarcinomes des glandes apocrines des sacs anaux.
Afin d’augmenter la possibilité de reconnaissance de l’hormone (qui correspond à l’antigène), des anticorps polyclonaux peuvent être utilisés dans les trousses commerciales de dosage. Il s’agit d’un mélange d’anticorps reconnaissant plusieurs épitopes d’un antigène donné, par opposition à un anticorps monoclonal ne reconnaissant qu’un seul type d’épitope. Cependant, en diminuant la spécificité antigénique, le risque de réaction avec d’autres molécules est augmenté. C’est par exemple le cas de la prednisolone et de la prednisone qui ne peuvent pas être différenciées du cortisol par les trousses commerciales.
Par ailleurs, les protéines de liaison des hormones dans le sang varient selon les espèces et peuvent intervenir dans les réactions antigène-anticorps des dosages. La variabilité des anticorps utilisés et de la spécificité antigénique rend les valeurs de référence variables d’une trousse à l’autre, pour la même hormone dans la même espèce.
À cela s’ajoute le fait que l’origine des échantillons étalons utilisés pour établir la courbe standard du dosage varie aussi suivant les trousses de dosage.
Cela explique pourquoi chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de référence (pour chaque hormone et dans chaque espèce) et qu’elles ne sont pas extrapolables d’un laboratoire à un autre. De même, il est recommandé de faire le suivi d’un dosage hormonal dans le même laboratoire et de ne pas se référer aux valeurs retrouvées dans les publications scientifiques.
La précision d’un test correspond à sa capacité à donner le même résultat lorsqu’un échantillon est mesuré plusieurs fois, soit à la suite dans les mêmes conditions analytiques (répétabilité), soit sur plusieurs cycles de mesure dans des conditions différentes (reproductibilité). Ce paramètre est défini par le coefficient de variation (CV) (encadré 4). Plus il est bas, plus la mesure est précise. Pour les dosages effectués en endocrinologie, un test avec une précision acceptable présente un CV de moins de 15 %.
Lors de l’interprétation d’un résultat, cette imprécision doit être prise en compte par le clinicien surtout lorsque la concentration se situe au seuil de prise de décision diagnostique : à titre d’exemple, une concentration en T4 totale de 15 nmol/l chez un chien, sachant que les valeurs usuelles du laboratoire se situent entre 15 et 45 nmol/l. Comme la précision est de 15 %, une nouvelle mesure de cet échantillon a 95 % de chances de se situer dans un intervalle compris en 9,5 et 20,5 nmol/l (15 +/- deux écarts-types), de confirmer ou d’infirmer une hypothyroïdie. Ainsi l’interprétation d’un résultat situé dans les valeurs seuils doit d’autant plus se baser sur la clinique et le degré de suspicion clinique de la dysendocrinie.
Pour un dosage donné, l’intervalle de mesures correspond à l’intervalle de concentrations au sein duquel la précision du dosage est acceptable (c’est-à-dire généralement un CV inférieur à 15 %). En fonction du ou des anticorps, mais surtout du système de révélation utilisé, l’intervalle de mesure peut être plus ou moins étendu. À titre d’exemple, certains automates sont capables de mesurer avec une bonne précision des cortisolémies inférieures à 10 nmol/l tandis que d’autres deviennent imprécis dès que les concentrations sont inférieures à 30 nmol/l. En pratique, cela permet de définir les limites de quantification du dosage (limites au-delà desquelles le dosage est trop imprécis pour qu’un résultat puisse être rendu). Avoir des limites de dosage plus larges permet de détecter des concentrations plus basses ou hautes ce qui peut notamment être intéressant dans le cas de suivi de traitement.
Plusieurs automates sont maintenant à la disposition du praticien pour réaliser des dosages hormonaux à la clinique(1). Comme pour tout test diagnostique, les conditions de stockage des réactifs et la réalisation du dosage doivent suivre les recommandations du fabricant.
Un stockage adéquat permet ainsi de préserver l’activité enzymatique des traceurs ainsi que la conformation des anticorps. Le respect des conditions d’utilisation de l’automate et de ces réactifs (volume de plasma ou sérum prélevé, mise à température ou non des réactifs, respect des temps d’incubation, etc.) est aussi primordial afin de se situer dans des conditions les plus proches possible de celles de la validation de la mesure [1].
Les dosages hormonaux présentent plusieurs particularités qui doivent être prises en compte pour la réalisation de l’analyse (respect des conditions préanalytiques et analytiques) et pour son interprétation. Les dosages hormonaux ont une plus faible précision que les dosages biochimiques classiques et il est nécessaire d’interpréter le résultat en fonction des valeurs de référence du laboratoire ou de l’automate utilisé.
(1) Voir l’article “Comment bien réaliser et interpréter un dosage hormonal à la clinique” de B. Rannou et coll. point vét. 2018;384:13-19.
(2) Médicament humain.
L’auteur a présenté des conférences pour Fujifilm et Virbac.
Une trousse (= kit) de dosage comprend l’ensemble des réactifs, des contrôles et des calibrateurs utilisés pour doser l’hormone. Elle peut être validée pour une ou plusieurs espèces.
→ La mesure s’effectue sur une plaque contenant 96 puits (photo 1). À chaque puits correspond une mesure en sachant que les analyses sont toujours réalisées deux fois (duplicata).
→ Les puits identifiés 1 à 4 correspondent à des solutions étalons dont la concentration est connue ; elles permettent d’établir la courbe étalon (figure 5).
→ Les puits identifiés 5 et 6 correspondent à des échantillons. L’échantillon 5 semble présenter une faible concentration en PTH (légère coloration bleutée) alors que l’échantillon 6 semble présenter une concentration très élevée en PTH (coloration intensément bleutée).
→ En raison de la faible quantité d’hormones dans le sang, les dosages hormonaux sont fondés sur une reconnaissance antigène-anticorps.
→ Un dosage hormonal validé dans une espèce n’est pas obligatoirement utilisable pour une autre.
→ Pour une même hormone et pour une même espèce, les valeurs usuelles varient suivant la trousse commerciale utilisée, donc selon les automates ou les laboratoires.
→ Les dosages hormonaux présentent généralement une assez faible précision (rarement inférieure à 10 %).
→ L’hémolyse est une coloration rougeâtre du plasma. Elle peut être d’origine in vivo, secondaire à une anémie hémolytique, mais est bien plus souvent d’origine in vitro. Dans ce cas, les causes d’hémolyse sont variées : aspiration ou éjection forcée de sang avec une aiguille de faible diamètre, inadéquation entre le volume du vide et le calibre veineux, agitation trop vigoureuse du tube, ou conservation trop longue du sang non centrifugé (plus de 6 à 12 heures). Une hémolyse est également fréquemment observée lors d’hyperlipémie.
→ Afin de limiter l’hémolyse, le tube doit être centrifugé et les cellules extraites le plus rapidement possible (et avant tout envoi au laboratoire) en utilisant pour le prélèvement, une aiguille de taille adéquate. Elle doit être courte (25 mm de longueur) et d’un diamètre de 18 à 21 G pour le chien et 20 à 22 G pour le chat. Pour des animaux de plus petite taille, son diamètre peut être plus petit (22 à 30 G). Cette aiguille est montée sur une seringue de 2,5 à 5 ml.
→ Un dosage réalisé plusieurs fois dans les mêmes conditions ne donne pas à chaque fois le même résultat. Cette variabilité peut être représentée sous la forme d’un graphique prenant la forme d’une courbe de Gauss (figure 6). La majorité des résultats obtenus est égale à la moyenne (X) et les autres résultats se distribuent de part et d’autre de cette moyenne :
- 68 % des résultats sont compris dans l’intervalle compris entre la moyenne (X) et plus ou moins un écart-type (ET) ;
- 95 % des résultats sont compris entre la moyenne (X) et plus ou moins deux ET.
Afin d’évaluer cette dispersion de résultats, le paramètre appelé coefficient de variation est utilisé qui est égal à (ET/X) ´ 100. Ce paramètre exprimé en pourcents permet d’évaluer la précision du dosage et de comparer les trousses de dosage.
