Une PCR en temps réel mesure l’excrétion de Coxiella burnetii

La polymerase chain reaction en temps réel (real-time PCR), également appelée PCR quantitative (q-PCR), est à distinguer de la RT-PCR ou reverse transcriptase PCR.

Dans le premier cas, il s’agit de copier et d’amplifier l’ADN bactérien, viral ou parasitaire via plusieurs cycles de copie successifs. Pour chacun, les liaisons faibles qui assurent la cohésion de la double hélice d’ADN sont rompues afin de donner deux simples brins d’ADN. Ensuite, des amorces spécifiques du gène à amplifier s’hybrident avec chaque brin et des désoxyribonucléotides sont ajoutés grâce à l’action d’une Taq polymérase. La technologie “en temps réel” permet de lire informatiquement les résultats pendant le déroulement de l’amplification.

Dans le second cas, le point de départ de la réaction n’est pas l’ADN, mais l’ARN. En effet, l’ARN extrait est d’abord transcrit en ADN complémentaire simple brin grâce à l’association d’une amorce et d’une reverse transcriptase, d’où le nom de RT-PCR. Par la suite, l’ADN obtenu par transcription est amplifié par PCR.

Lors de la Journée bovine nantaise du 6 octobre dernier, notre confrère Eric Sellal, directeur du Laboratoire Service International (LSI), a présenté le kit LSI TaqVet® Coxiella burnetii, une technique de PCR en temps réel pour la détection de cette bactérie.

Cette PCR, dite “multiplex”, détecte simultanément deux gènes dans la même réaction et dans une seule cupule : le gène transposon utilisé pour déceler l’ADN de Coxiella burnetii et le gène codant pour l’enzyme glycéraldéhyde-3-phosphate-déshydrogénase (GAPDH), spécifique des ruminants (voir encadré). « La GAPDH est présente dans toutes les cellules, explique Candice Alix, responsable du développement PCR Coxiella chez LSI. Pour chaque espèce, elle développe des caractéristiques spécifiques. »

L’amplification du gène GAPDH permet d’apporter un résultat quantitatif

Le gène GAPDH est utilisé comme contrôle positif interne, encore appelé IPC (internal positive control). En effet, son amplification permet de vérifier l’intégrité de l’échantillon analysé, la qualité de l’extraction de l’ADN, l’absence de facteurs inhibant la Taq polymérase, et de contrôler les conditions de déroulement de la PCR.

Les résultats d’amplification du gène GAPDH permettent de corriger ceux du transposon de C. burnetii et, in fine, de les interpréter en quantité de bactéries présentes dans l’échantillon. « Il s’agit de quantification absolue normalisée par l’IPC », précise Eric Sellal (^{voir tableau 1}).

Ecouvillon vaginal et lait sont prélevés chez 7 chèvres qui ont avorté suite à la fièvre Q depuis moins de huit jours. Les résultats obtenus par la PCR en temps réel montrent une excrétion de Coxiella par la voie vaginale élevée et un niveau d’excrétion dans le lait plus faible. Les résultats indiquent 4 écouvillons vaginaux classés +++, et 3 ++ ; 3 laits individuels négatifs, 1 douteux, et 3 +.

L’analyse de 14 laits ou fromages crus de bovin ou de caprin destinés à la consommation humaine montre la présence d’ADN de Coxiella burnetii à des niveaux élevés (^{voir tableau 2}). Ces résultats concordent avec ceux publiés aux Etats-Unis : 94 % des laits de tank d’origine bovine ont été trouvés positifs en PCR fièvre Q conventionnelle (Kim et coll., 2005). Eric Sellal rappelle qu’en matière de fièvre Q, le risque de contamination humaine par voie alimentaire est faible. En outre, « mettre en évidence de l’ADN bactérien n’établit pas la viabilité, donc le caractère infectieux de la bactérie ».