Un œil critique sur les nouvelles thérapies biologiques : introduction

La profession vétérinaire équine semble en avance dans le monde scientifique en ce qui concerne les thérapies biologiques régénératives. Celles-ci sont utilisées dans le traitement des tissus endommagés dont la capacité de réparation est assez limitée.

L’objectif de ces nouvelles thérapies est de rétablir les propriétés physiques et mécaniques du tissu d’origine en mettant en œuvre les propres ressources d’un individu donné.

Leur usage est très attractif chez les chevaux de course et de sport car, contrairement à l’administration de médicaments, les cellules souches et autres thérapies biologiques dites régénératives ne sont pas soumises aux mêmes types de contrôle (innocuité et efficacité). De plus, aucun délai d’attente n’est à respecter avant une compétition pour les produits d’origine biologique au sens strict [²⁹].

Ces nouvelles thérapeutiques biologiques dites régénératives peuvent être classées en trois grands groupes : les thérapies d’origine sanguine, les thérapies de type cellulaire et le génie tissulaire. En ce qui concerne leurs applications, deux courants existent actuellement dans le monde de la médecine régénérative : l’application directe de cellules souches ou de facteurs de croissance dans le site lésé ou à la périphérie de celui-ci, en espérant une migration vers la région lésionnelle ou le génie tissulaire, qui consiste à recréer un tissu in vitro et à l’implanter directement pour réparer la zone lésée [²¹].

Thérapies d’origine sanguine

Les deux thérapies sanguines les plus couramment utilisées dans le milieu équin sont le plasma riche en plaquettes (PRP) et la protéine antagoniste du récepteur de la cytokine interleukine 1 (Irap) qui provient du sérum autologue conditionné (SAC). Ces produits proviennent tous deux du sang, mais ils sont très différents l’un de l’autre et ont la particularité d’être des mélanges de cytokines avec un contenu difficile à caractériser. Ces agents biologiques sont devenus très populaires au cours des 5 à 10 dernières années. Le concept d’autogreffe est très attrayant pour le praticien et le propriétaire car le potentiel intrinsèque de l’animal est utilisé comme traitement, afin d’obtenir des résultats régénératifs. En revanche, le caractère autologue de ces traitements les rend extrêmement difficiles à étudier de façon rigoureuse car un produit autologue comme le PRP ou l’Irap n’est jamais administré à 2 chevaux différents. Ce sont des mélanges de cytokines et leur composition est unique pour chaque individu et à un instant t. Les moyens de préparation de ces produits ont été adaptés de la médecine humaine à la médecine vétérinaire avec très peu, voire, dans certains cas, aucune validation scientifique avant leur mise sur le marché [³¹].

Bien que ces deux traitements soient classés dans le même groupe, leur application est destinée à des usages différents. Pour le PRP, c’est l’effet anabolique, grâce aux facteurs de croissance des plaquettes (thrombocytes), qui est recherché. Celui-ci a pour objectif d’améliorer la phase initiale de la guérison tissulaire. L’Irap vise à inhiber la cascade inflammatoire initiée par l’interleukine 1. Elle aurait donc une fonction plutôt de type anticatabolique et/ou anti-inflammatoire. Pour une thérapie biologique idéale, il peut être judicieux de combiner les deux thérapies pour obtenir un effet à la fois anabolique et anticatabolique [¹, ²²].

Plasma riche en plaquettes

Dès les années 1980, les chercheurs ont commencé à étudier le potentiel de guérison du PRP et ont observé que celui-ci était plus efficace qu’un traitement classique avec de facteurs de croissance sur la régénération osseuse mandibulaire [¹⁸]. Par la suite, les PRP ont été utilisés en médecine à la fois humaine et équine lors d’affections ligamentaires et tendineuses [³¹]. Les PRP sont caractérisés par un taux de thrombocytes plus élevé que dans le sang. Dans ces thrombocytes, un contenu élevé en facteurs de croissance qui se trouvent dans le granule α des thrombocytes est observé, ceux-ci ayant pour objectif d’accélérer la guérison tissulaire en tant qu’agents anaboliques [³¹]. Plus précisément, le prélèvement de sang est effectué sur un tube qui comporte des anticoagulants, et ce contenu est centrifugé et séparé en trois couches (^{photo 1}). Les couches supérieures et intermédiaires sont prélevées et centrifugées de nouveau pour obtenir un maximum de thrombocytes dans un volume réduit de plasma. La concentration approximative de thrombocytes est de 1 000 × 10³/µl [¹²]. Ce chiffre a été extrapolé de la médecine humaine, mais semble correspondre à ce qui est observé chez le cheval [³¹]. Il est question de PRP à partir du moment où la concentration en plaquettes est plus importante que dans le sang, mais, dans les faits, une multiplication au moins par 4 de la concentration en plaquettes est recherchée lors du processus de préparation. Les composants du PRP sont :

– des thrombocytes contenant des facteurs de croissance, principalement le facteur de croissance transformant, (TGF-β) et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) ;

– des protéines plasmatiques ;

– des hématies et leucocytes.

La présence de leucocytes dans certaines préparations de PRP et leurs effets potentiels sur le tissu receveur restent encore très controversés. Bien qu’ils soient nécessaires dans les phases initiales de l’inflammation, il a été démontré que, dans le PRP, les leucocytes produisent des enzymes cataboliques et de l’IL-1, et peuvent induire de la douleur et des lésions musculaires [¹⁹, ²⁰, ³²].

L’obtention du plasma, comme décrite précédemment, reste assez simple. En revanche, la préparation des PRP requiert quelques précautions pour éviter d’obtenir une concentration basse de thrombocytes et de ne pas activer les thrombocytes prématurément, ce qui entraînerait le relargage de facteurs de croissance dans la fraction totale de plasma et diminuerait leur concentration dans le produit final [³¹]. Plusieurs méthodes sont mises en œuvre pour préparer le PRP et cela se traduit donc par un manque de standardisation qui rend difficile la comparaison des résultats des différentes études scientifiques. Cela pourrait expliquer les résultats controversés récemment publiés [⁸]. L’optimisation des protocoles reste donc essentielle pour maximiser l’apport de thrombocytes et obtenir un ratio de facteurs de croissance favorable à la guérison dans le site lésé, tout en minimisant la quantité de leucocytes [⁶].

Protéine antagoniste du récepteur de l’interleukine 1 et sérum autologue conditionné

La protéine antagoniste du récepteur de la cytokine interleukine 1 (Irap) est une cytokine anti-inflammatoire et anticatabolique qui inhibe la cascade de l’inflammation initiée par la cytokine pro-inflammatoire interleukine 1 (IL-1), celle-ci étant l’instigatrice de nombreuses arthropathies inflammatoires et dégénératives. Le gène équin de l’Irap a été cloné en 1997 et depuis des injections intra-articulaires ont été effectuées chez le cheval sur des modèles d’ostéoarthrose avec des résultats positifs [⁹, ¹⁰, ¹⁶]. En médecine humaine, l’Irap est utilisée dans le traitement de l’arthrite rhumatoïde [³]. Elle a été commercialisée initialement en 2003 chez le cheval par une compagnie allemande, sous le nom d’Orthokine®. Actuellement, une compagnie américaine distribue ce traitement dans une version modestement améliorée, sous le nom d’Arthrex ABPS® [¹⁴]. Ce n’est pas une solution pure d’Irap, mais plus exactement un sérum autologue conditionné, car le sang prélevé de l’animal est mis en culture dans une seringue contenant des billes de verre pendant 24 heures (^figure). Après cette période d’incubation, un sérum avec de l’Irap est obtenu, mais la composition exacte de cette soupe de substances sanguines reste encore largement inconnue [¹⁰]. L’emploi d’anticoagulant (héparine 1 µl/ml) lors du prélèvement de sang semble aussi modifier la composition de cette soupe [¹⁴]. Plusieurs études ont démontré que le sérum autologue présente une augmentation non seulement d’Irap mais aussi de cytokines indésirables, comme l’IL-1 et le TNF-α [¹⁴, ²⁷].

Une étude récente a comparé l’ancienne et la nouvelle version de sérum autologue conditionné équin avec un sérum prélevé simplement sur un tube sec et incubé pendant 24 heures. Le résultat obtenu a établi que le sérum prélevé simplement sur tube sec et la première version du sérum autologue conditionné contiennent à 24 heures la même quantité d’Irap alors que la nouvelle version du sérum autologue conditionné (Arthrex ABPS®) renferme plus d’Irap [¹⁴]. Les chercheurs ont également relevé une grande variabilité individuelle dans la réponse après 24 heures d’incubation sur les billes de verre entre les différents chevaux inclus dans cet essai [¹⁴].

Seule une étude a exploré les effets du sérum autologue conditionné chez le cheval dans un modèle expérimental d’ostéoarthrose assez sévère (fragment ostéochondral en regard de l’os radial du carpe). L’ancienne version du sérum autologue conditionné (Orthokine®) a été injectée aux jours 14, 21, 28 et 35 après création de la lésion articulaire. Une régression de la boiterie a été observée 70 jours après induction de la lésion, mais aucun progrès n’a pu être détecté sur le plan histologique [¹⁰].

Le sérum autologue conditionné semble populaire en pratique, et chez les chevaux de sports en particulier. Des praticiens ont rapporté de manière anecdotique que ce produit peut se révéler efficace dans certains cas d’inflammation articulaire quand les corticostéroïdes ne font plus effet. Les résultats du traitement semblent être visibles après la seconde injection et persister entre 3 mois et 1 an [³¹].

Bien que des résultats semblent encourageants, les coûts du traitement et le manque d’essais cliniques contrôlés (traitement versus placebo ; double aveugle) sont les facteurs limitants de cette thérapie.

Cellules souches

Les cellules souches réparatrices dans le traitement des maladies myo-arthro-squelettiques sont majoritairement représentées par les cellules souches mésenchymateuses adultes prélevées à partir de différents tissus, comme la moelle osseuse, le tissu adipeux, la membrane synoviale, le placenta, le cordon ombilical, le sang de cordon (ou placentaire) et le sang périphérique. Aucun vrai marqueur spécifique n’a été mis au jour pour identifier ces cellules souches chez le cheval, les marqueurs cellulaires de surface qui existent chez l’humain ne réagissant pas avec les cellules souches équines. À l’heure actuelle, même si cette technique reste grossière et probablement imprécise, la seule façon d’identifier des cellules souches équines reste de mettre en évidence leur potentiel d’adhésion au plastique combiné à leur capacité de se différencier en plusieurs lignées : ostéogénique, chondrogénique et adipogénique (^{photos 2a} à ^2c) [²⁵].

Il est désormais démontré que l’origine tissulaire des cellules souches prélevées a un impact direct sur leur facilité à régénérer tel ou tel type de tissu. Ainsi, logiquement, les cellules qui proviennent des tissus articulaires présentent le meilleur potentiel de différenciation chondrogénique [³³]. Dans une récente étude équine, il a été démontré que les cellules embryonnaires ont un taux de survie après injection dans un tendon lésé significativement plus élevé que les cellules souches provenant de la moelle osseuse. Les cellules embryonnaires étaient encore vivantes après 90 jours. En revanche, les cellules de la moelle osseuse présentaient un taux de survie inférieur à 5 % à 10 jours et celui-ci diminuait encore par la suite [¹³]. Cependant, pour des raisons pratiques et éthiques, ce ne sont pas les cellules les plus couramment utilisées, en médecine humaine comme en médecine vétérinaire [²⁵, ³⁴]. À l’avenir, l’idéal serait d’identifier la source optimale de cellules souches selon le tissu à traiter. Actuellement, les cellules souches de la moelle osseuse et de la graisse restent les sources les plus populaires en médecine vétérinaire, et ce pour des raisons pratiques. Aucune étude ne propose de moment optimal pour l’injection, mais celui-ci dépend du type d’affection à traiter. Dans tous les cas, pour les troubles cartilagineux, tendineux ou osseux, il convient d’attendre que la phase d’inflammation aiguë soit terminée [²⁶].

Cellules souches issues de la moelle osseuse

L’aspiration de moelle osseuse reste le geste le plus couramment pratiqué pour l’obtention de cellules souches en médecine vétérinaire⁽¹⁾. Elle présente certains désavantages car la méthode d’obtention peut être douloureuse et dangereuse pour le cheval (risque de ponction de la plèvre, du péricarde ou du cœur) si le praticien est peu familier de ce procédé, risqué pour le vétérinaire et, finalement, le ratio de cellules souches obtenues par quantité de liquide est assez faible, comparé avec d’autres tissus du corps où les cellules peuvent également être prélevées [²⁵]. Une fois le liquide obtenu, les cellules sont soit injectées directement dans le site à traiter, soit isolées puis mises en culture par le phénomène d’adhésion au plastique pour obtenir une séparation des cellules hématopoïétiques. Une population pure de cellules souches peut être obtenue après 7 jours de culture in vitro (^{photo 3}). L’injection simple de moelle osseuse peut être préjudiciable au tissu receveur car le prélèvement brut est pauvre en cellules souches et de grands volumes sont alors nécessaires [²³]. En revanche, après la mise en culture des cellules et leur prolifération, elles peuvent être centrifugées et concentrées de nouveau dans un vecteur comme de la fibrine ou du plasma, ce qui permet de réduire le volume d’injection tout en gardant une forte concentration de cellules souches [⁷].

Cellules souches issues du tissu adipeux

Les cellules souches qui se trouvent dans le tissu adipeux restent, après la moelle osseuse, celles qui sont le plus couramment utilisées chez le cheval⁽²⁾. Par rapport à la moelle osseuse, ce tissu est facile et moins douloureux à prélever, et se trouve en grande quantité dans l’organisme. De nombreuses études ont comparé le potentiel de multiplication et de prolifération des cellules souches graisseuses versus celui des cellules de la moelle osseuse. Les résultats sont assez controversés et les données qui démontrent que la qualité est similaire à celle des cellules souches de la moelle osseuse restent encore insuffisantes [²⁵]. Quelques essais réalisés chez le cheval ont démontré qu’aucune différence n’existe entre ces deux types de cellules [⁵]. D’autres chercheurs ont rapporté que la population de cellules souches dans le tissu adipeux était supérieure à celle de la moelle osseuse, et vice versa [⁴, ¹¹].

Des thérapies commerciales à base de cellules souches équines d’origine adipeuse existent désormais pour traiter différentes maladies myo-arthro-squelettiques. Certains laboratoires renvoient les cellules après un isolement et une mise en culture de 14 jours. Cependant, d’autres officines les réexpédient sous 48 à 72 heures et elles ne peuvent alors être considérées comme une véritable thérapie fondée sur l’emploi de cellules souches, au même titre que l’administration de moelle osseuse brute juste après le prélèvement. En effet, ces techniques consistent à prélever le tissu graisseux, à l’envoyer à un laboratoire, et, sous 48 à 72 heures, l’échantillon prêt à être administré est renvoyé au vétérinaire. Cet échantillon consiste en un lysat cellulaire contenant un très faible nombre de cellules souches et un grand nombre de cellules adipeuses et autres cellules sanguines. Le ratio cellules souches versus quantité de tissu est très bas dans le tissu adipeux, donc une grande quantité de tissu est nécessaire pour produire un nombre comparable de cellules souches à ce qui est obtenu avec de la moelle osseuse. Sous 48 à 72 heures, une population pure de cellules souches ne peut pas être obtenue. Il serait donc plus judicieux de parler de traitement avec des cellules adipeuses stromales, et non de thérapie à base de cellules souches d’origine adipeuse avec ce type de préparation [²⁵]. Une étude a démontré que les cellules souches d’origine adipeuse cultivées pendant plusieurs semaines en laboratoire sont plus efficaces pour la néovascularisation et la guérison osseuse, par rapport aux cellules adipeuses stromales (non cultivées) [²].

Cellules souches issues du cordon ombilical et sang placentaire

Le cordon ombilical et le sang de celui-ci sont prélevés chez le cheval de façon courante. De nombreuses entreprises à travers le monde proposent déjà ce service. Le prélèvement se réalise assez facilement quand la jument met bas⁽³⁾. Contrairement aux cellules souches de la moelle osseuse et du tissu adipeux, le rendement cellulaire des cellules souches du sang de cordon (placentaire) est très bas [²⁴]. En moyenne, sur sept échantillons prélevés, seulement quatre vont former des colonies contenant des cellules souches. Cette caractéristique est également observée chez l’homme [²⁵].

Génie tissulaire

Le génie tissulaire est une nouvelle technologie dont l’objectif thérapeutique est de recréer, de régénérer ou de restaurer la fonction d’un tissu lésé, en utilisant la coalescence de trois éléments : un biomatériau, des cellules réparatrices et des facteurs environnementaux [³⁴]. Le plus grand défi du génie tissulaire est donc de mimer ou de recréer in vitro les modèles qui sont représentatifs de la situation in vivo.

L’application et la compréhension de la biologie de ses trois composants sont de plus en plus étendues dans le domaine de la médecine équine, alimentées par de meilleurs biomatériaux et une appréhension approfondie des biofacteurs individuels et des sources des cellules. Des études contrôlées et de qualité sont requises pour faire progresser ce domaine innovant de la recherche équine [¹⁷].

Dans les tissus recréés par génie tissulaire, les cellules doivent répondre à un phénotype précis. La composition et l’organisation architecturale de la matrice extracellulaire doivent reproduire les propriétés biomécaniques du tissu à remplacer, comme la contiguïté, l’intégrité et l’unité entre le nouveau tissu et les structures environnantes [³⁰]. Pour qu’un type de biomatériau soit utilisé en génie tissulaire, sa non-toxicité, sa porosité et sa perméabilité sont requises. Les biomatériaux peuvent être d’origine synthétique ou biologique, dégradable ou non, et doivent favoriser la néovascularisation, la migration des cellules et la production de matrice extracellulaire [¹⁵, ³⁰, ³⁵]. Le nombre d’études équines orientées vers le génie tissulaire reste encore extrêmement restreint. Celles-ci sont dirigées vers la recherche myo-arthro-squelettique et seront discutées dans les prochains chapitres.

Conclusion

L’engouement pour les récentes thérapies biologiques et les avancées de la biologie des cellules souches, des facteurs de croissance et des sciences des biomatériaux ont contribué à faire de ces thérapeutiques biologiques innovantes une stratégie prometteuse pour la réparation et la régénération des tissus.

La commercialisation depuis peu de nombreux produits d’origine biologique et le manque de preuves scientifiques sur leur efficacité rendent le choix difficile pour le praticien.

En prenant le tendon comme exemple, une réduction de 40 % du taux de récidive de tendinite chez des steeple-chasers semble être observée à la suite d’une injection intralésionnelle de cellules souches autologues provenant de la moelle osseuse [²⁸]. Il est donc possible de parler d’une avancée scientifique, même s’il est extrêmement difficile d’interpréter avec certitude les résultats d’une étude clinique non contrôlée (pas de population similaire recevant un traitement traditionnel = contrôle) et qui n’est pas réalisée en double aveugle (vétérinaires traitants et entraîneurs/propriétaires au courant du type de thérapie instauré). Ces biais importants et difficilement maîtrisables sont inhérents à ce type de travaux. Cependant, et malgré des résultats encourageants, ces thérapies sont encore loin de permettre la régénération d’un tissu totalement fonctionnel et comparable à la structure saine.

• (1) Voir l’article “Prélèvement de moelle osseuse” des mêmes auteurs, dans ce numéro.

• (2) Voir l’article “Prélèvement de tissu adipeux” des mêmes auteurs, dans ce numéro.

• (3) Voir l’article “Prélèvement du cordon ombilical et de sang placentaire” de T. Vinardell et coll., dans ce numéro.

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