Relation entre les myélo-encéphalopathies à herpèsvirus équin 1 et le génotype viral - Pratique Vétérinaire Equine n° 173 du 01/01/2012
Pratique Vétérinaire Equine n° 173 du 01/01/2012

Article de synthèse

Auteur(s) : Stéphane Pronost*, Christine Fortier**, Pierre-Hugues Pitel***, Guillaume Fortier****

Fonctions :
*Laboratoire Frank Duncombe, 1, route de Rosel,
14053 Caen Cedex 4. Pôle recherche,
EA 4655 U2RM,
Université de Caen Basse-Normandie.
**Laboratoire Frank Duncombe, 1, route de Rosel,
14053 Caen Cedex 4. Pôle recherche,
EA 4655 U2RM,
Université de Caen Basse-Normandie.
***Laboratoire Frank Duncombe, 1, route de Rosel,
14053 Caen Cedex 4. Pôle recherche,
EA 4655 U2RM,
Université de Caen Basse-Normandie.
****Laboratoire Frank Duncombe, 1, route de Rosel,
14053 Caen Cedex 4. Pôle recherche,
EA 4655 U2RM,
Université de Caen Basse-Normandie.

Il existe deux types de souches d’herpèsvirus équin 1 : neuropathogène et non neuropathogène. L’infection par l’une ou l’autre peut entraîner l’expression clinique des différentes formes de la maladie.

L’herpèsvirus équin 1 (HVE-1) est responsable d’avortements et de mortinatalités, d’affections respiratoires chez les jeunes chevaux et de myélo-encéphalopathies chez les chevaux adultes. Il est difficile de savoir s’il convient de classer les myélo-encéphalopathies à HVE-1 (EMH) dans les formes rares des maladies induites par ce virus. Une réelle augmentation des cas rapportés par Goehring et coll. et Henninger et coll. a conduit l’United States Department of Agriculture en 2007 à classer l’EMH comme maladie résurgente [5, 8, 18]. En France, durant les années 2009 et 2010, trois épisodes ont été rapportés impliquant à chaque fois plusieurs chevaux(1). Toutefois, en 2010, Goerhing et coll. suggèrent de rester prudent face à une recrudescence apparente de la maladie, qui peut n’être qu’une surestimation traduisant le regain d’intérêt des praticiens et des chercheurs pour le sujet [6]. La découverte de deux types de souches d’HVE-1 nommées souche neuropathogène et souche non neuropathogène a participé à cette perception dans la communauté scientifique. Cet article a pour objectif de présenter les travaux qui ont conduit à la différenciation entre ces deux types de souches, d’une part, et les questions qui demeurent sur cette relation génotype/pathotype à la suite des observations de terrain, d’autre part (encadré).

Différenciation des types de souches d’HVE-1

Historique

La nature et la sévérité des différentes formes des affections induites par l’HVE-1 dépendent de plusieurs facteurs comme l’âge, le statut immunitaire et l’état de santé général de l’animal [9]. Cependant, le potentiel pathogène des souches incriminées peut également jouer un rôle important dans le développement des signes cliniques.

Les études sur la diversité des souches ont été réalisées selon deux approches : par digestion enzymatique (Restriction Fragment Length Polymorphism ou RFLP) au cours des années 1980 et par comparaison de génomes complets plus récemment.

Les premiers travaux de typage Restriction Fragment Length Polymorphism

La première étude de typage (RFLP) sur un nombre significatif de souches d’HVE-1 a été réalisée par Allen et coll. en 1985 et a permis, après digestion de l’ADN viral par cinq enzymes de restriction (BamHI, EcoRI, BgII, SaII et SstI), de mettre en évidence deux profils de souches d’HVE-1 à partir d’un panel de 297 souches issues de 172 épisodes cliniques différents : 148 avortements et 24 épisodes respiratoires [3]. Ces deux profils, nommés respectivement “EHV-1 P” et “EHV-1 B”, représentaient 90 % des souches analysées. “EHV-1 P” était identifié majoritairement chez les souches isolées lors d’avortement entre 1960 et 1980 aux États-Unis. À partir de 1981, c’est le profil “EHV-1 B” qui est retrouvé dans la plupart des cas d’avortement, montrant ainsi les limites de cette classification.

D’autres approches de type RFLP ont été réalisées dans différents pays. Ainsi, en 1993, Zientara et coll. ont confirmé qu’il n’était pas possible de différencier les souches abortives des souches respiratoires par digestion enzymatique (BamHI et PstI) sur 16 souches d’HVE-1 (4 respiratoires et 14 abortives) isolées en France entre 1983 et 1991 [21].

L’ensemble de ces travaux, ainsi que d’autres études menées au Japon et en Argentine ont montré les limites de la seule utilisation de la méthode RFLP restreinte à quelques enzymes.

Dès 1985, George Allen avait alerté sur l’ambiguïté d’adopter une terminologie qui repose sur la pathologie. Les termes alors employés étaient Respiratory and Fetal, pour caractériser les deux profils de souches HVE-1 mis en évidence par une méthode de typage moléculaire (RFLP).

Nous allons voir dans cet article comment, 25 ans plus tard, la même prudence a dû s’imposer pour deux formes différentes d’infection à HVE-1 (l’avortement d’un côté et l’EMH de l’autre) face à une nouvelle approche moléculaire (la Single Nucleotide Polymorphism-PCR ou SNP-PCR).

Les travaux de Josie Nugent (Newmarket, Royaume-uni)

Une étude initiée en 2001 par Nugent et coll. a consisté à comparer la séquence complète de deux virus HVE-1 issus d’animaux qui ont présenté des signes cliniques différents [10]. C’est en 2006 que les résultats de ces travaux ont été présentés de façon exhaustive [11]. Les souches Ab4 et V592 d’HVE-1 issues du terrain et isolées chez des chevaux ayant présenté respectivement des symptômes nerveux et des avortements sans symptômes nerveux ont servi de support à cette étude.

La comparaison de ces deux séquences a montré 0,1 % de divergence avec cinquante régions qui présentent soit des délétions, soit des insertions d’un ou de plusieurs nucléotides. Cent dix Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) ont été détectés et, parmi ceux-ci, 43 se traduisaient par un chan­gement d’acide aminé, ce qui peut potentiellement entraîner des divergences dans la physiopathologie de la maladie.

Les auteurs ont ensuite recherché l’expression de ces différences sur une population de 131 souches d’HVE-1 et ont montré que la base G2254 de l’ORF30 codant l’ADN polymérase était associée de manière significative aux souches provenant d’épisodes nerveux (p < 0,0001) alors que la base A2254 l’était aux épisodes abortifs qui ne présentaient aucun cas de forme clinique nerveuse.

Les souches porteuses de la base G2254 correspondent à l’acide aminé acide aspartique (D) en position 752 et sont également appelées formes mutantes, souches paralytiques ou souches neuropathogènes. Les souches porteuses de la base A2254 correspondant à l’acide aminé asparagine (N) sont appelées formes sauvages, souches abortives ou souches non neuropathogènes (figure 1).

Sur les 131 souches étudiées en provenance de tous les continents, 95 % (78/82) des souches liées à des épisodes non nerveux possédaient la base A2254 sur l’ORF30 alors que 86 % (42/49) des souches liées à des épisodes nerveux possédaient la base G2254.

Confirmation de l’importance de la mutation G/A2254 : approche fondamentale par génétique inverse

Pour confirmer le rôle potentiel de cette mutation, Goodman et coll. ont réalisé deux infections expérimentales [7]. Elles ont porté sur des poneys (4 animaux) et des chevaux (7, plus âgés) à partir des deux types de souches d’HVE-1 : la souche Ab4 (D752 ; paralytique) et une souche mutante “N752” construite à partir de la souche Ab4 par mutagenèse dirigée. Le remplacement de la base 2254 (de la base G2254 à A2254) a conduit au remplacement de l’acide aspartique D par l’asparagine N. Le reste du génome était alors conservé. Les auteurs ont ainsi montré que le mutant “N752” n’entraînait pas de signes neurologiques chez les chevaux infectés alors que la souche D752 était capable de provoquer une réaction inflammatoire au niveau du système nerveux central, ainsi que de l’ataxie. Si les résultats de cette étude sont significatifs, en particulier sur la mesure de la virémie, tant dans son amplitude que dans sa durée, les auteurs ont ­néanmoins souligné que seulement 2 chevaux inoculés avec le mutant “N752” sur 7 ont présenté des signes cliniques (autres que nerveux) d’intensité modérée.

En 2009, Van de Walle et coll. ont réalisé le même type d’expérience, sur 6 chevaux adultes, à partir d’une souche non neuropathogène (NY03) qui a subi une mutation (de la base A2254 à G2254). Ils ont montré que la souche “NY03 mutée” a entraîné la mort d’un animal après l’apparition de signes cliniques neurologiques sévères [19].

Les auteurs ont conclu que, au vu de ces deux expérimentations par mutagenèse dirigée, la mutation est suffisante pour conduire à la mort des chevaux par EMH.

Quels sont les résultats observés sur le terrain ?

L’outil de typage

Pour caractériser les différentes souches isolées sur le terrain, un test SNP-PCR a été développé par Allen et coll. (figure 2) [1]. Il repose sur l’amplification par polymerase chain reaction (PCR) de l’ADN du virus afin d’obtenir une quantité suffisante pour la détection de la mutation par des sondes moléculaires spécifiques possédant des fluorophores différents.

Étude française

Ce travail a été réalisé en s’appuyant, pour l’ensemble des critères pathologiques, sur une souchothèque. Elle est constituée de souches isolées à la suite des avortements à HVE-1 confirmés après une autopsie réalisée dans un centre expert reconnu (le Laboratoire d’études et de recherches en pathologie équine, Anses, Dozulé). Ces critères reposent aussi sur le sous-réseau “maladie neurologique” du Respe (Réseau d’épidémiosurveillance des pathologies équines), pour la validation du recrutement des échantillons d’HVE-1 responsables de myélo-encéphalopathies. L’avantage de ce réseau a été la prise en compte systématique d’un diagnostic différentiel et une homogénéité dans la définition des cas cliniques [13].

Cette étude a porté sur 125 souches d’HVE-1 qui provenaient pour 16 d’entre elles de cas d’EMH, pour 24 d’affections respiratoires et pour 85 d’avortements. 24 % ont présenté le génotype G2254 et étaient réparties de la façon suivante : 7 pour les cas d’EMH, 1 pour les cas respiratoires et 22 pour les avortements (tableau 1). Les 7 cas d’EMH observés sont issus de deux épisodes recensés en 2009 pour lesquels des euthanasies ont dû être pratiquées en raison de la gravité des symptômes. Cela pourrait suggérer que les souches de 2009 sont plus virulentes que celles détectées auparavant [13].

Cependant, quelle que soit la clinique, il convient de rappeler que l’ensemble des souches d’HVE-1 sont pathogènes et doivent entraîner des mesures de précaution. Le typage des souches reste utile sur le terrain, car il permet d’apprécier le risque qui est accru en présence d’une souche neuropathogène, et au laboratoire de recherche car il permet de mieux comprendre les mécanismes de neuropathogenèse de l’HVE-1 (figure 3) [13].

Ces travaux montrent enfin qu’une corrélation stricte entre le génotype et l’expression de la maladie ou le pathotype n’est pas retrouvée sur le terrain. Qu’en est-il dans les autres pays ?

Études réalisées dans d’autres pays

La piste d’un typage moléculaire qui permet de différencier les souches d’HVE-1 impliquées dans différentes formes de l’affection a entraîné la réalisation d’études de terrain sur l’ensemble des continents [4, 15-17, 20]. Leurs résultats publiés entre 2009 et 2011 montrent que, comme pour les souches HVE-1 isolées en France, il est possible de détecter des souches sauvages lors d’EMH, mais également des souches mutantes lors d’avortements (tableau 2). Ces études ont été réalisées dans le cadre d’essais rétrospectifs sur des souches conservées à – 80 °C. L’essentiel était issu d’organes récupérés à la suite d’avortements, ce qui est en accord avec la pathologie liée à ce virus. Peu de souches issues d’EMH étaient donc disponibles pour ces études et, en ce qui concerne les travaux réalisés en Allemagne et en Argentine, les cas d’EHM avaient été observés dans des haras qui avaient également présenté des avortements à HVE-1. Cette observation a été faite en France lors d’un épisode survenu en 2009(2).

Comme pour l’étude de typage des souches françaises, il n’existe pas 100 % de corrélation entre le type de souches de virus détecté et certaines formes de la maladie. La détection de la forme mutée sur des prélèvements issus d’avortements survenus dans les années 1950 a montré que cette souche était déjà présente au moins à cette époque sur le continent américain [16]. Les auteurs ont également montré que la prévalence des souches mutantes a augmenté de 1960 à nos jours (1960 à 1970 : 3,3 % ; 1990 à 2000 : 14,4 % ; 2000 à 2006 : 19,4 %).

Que peut-on conclure aujourd’hui ?

Les travaux publiés par Nugent et coll. en 2006 ont marqué un tournant dans la caractérisation des souches d’HVE-1 [11]. Les auteurs ont en effet ouvert la voie pour la différenciation des souches par la détection de mutations (comme la G/A2254 présentée dans cet article), mais également par le séquençage de certains cadres de lecture, ou Open Reading Frame (ORFs). Ces travaux ont également souligné que, contrairement à d’autres virus comme ceux de l’artérite virale équine ou la grippe équine, les connaissances au niveau des génomes d’HVE-1 sont encore insuffisantes pour réaliser des études épidémiologiques pertinentes avec un protocole international faisant consensus. De nouvelles approches sont en cours avec la technologie de séquençage de nouvelle génération NGS. Cette technologie rend aujourd’hui accessible très rapidement le séquençage de génomes viraux complets. Le défi réside en grande partie dans une caractérisation sans faille des affections observées en association avec les souches identifiées. En effet, la détection de génomes ne peut, à elle seule, conduire à un diagnostic et doit s’appuyer sur une observation clinique poussée et d’autres approches lorsque cela est possible (recherche d’autres agents pathogènes dans le cadre du diagnostic différentiel) (photos 1, 2a et 2b).

En attendant, le typage des souches HVE-1 par la recherche de la mutation en position 2254 sur l’ORF30 renseigne sur la virulence de la souche et sur le risque accru de voir apparaître une forme nerveuse chez l’animal infecté. En effet Allen et Breathnach ont montré que les souches paralytiques présentaient une virémie plus importante tant dans l’amplitude que dans la durée et que le risque de dissémination du virus était donc plus important [2]. Une étude de Perkins et coll. a postulé un risque 162 fois plus important de voir se développer une EMH chez un cheval infecté par une souche neuropathogène [12].

Conclusion

La mutation à elle seule ne peut expliquer l’apparition des différentes formes de maladies à HVE-1. Si une mutation au niveau de l’ADN polymérase peut suggérer une différence dans la vitesse de réplication du virus, d’autres mutations ont été observées sur l’ORF30 (gène codant l’ADN polymérase) et non encore étudiées [14]. Les premiers résultats de Nugent et coll. n’avaient pas non plus démontré une parfaite corrélation entre le génotype et le pathotype (95 % des souches liées à des épisodes non nerveux possédaient la base A2254 et 86 % des souches liées à des épisodes nerveux, la base G2254) [11].

Quel que soit le type de souche détectée, il est essentiel de prendre les mesures sanitaires qui s’imposent(2). En effet, toutes les études montrent que la meilleure façon de lutter contre les infections à HVE-1 demeure l’isolement strict des animaux infectés avec une gestion par lots et un suivi par des tests PCR.

  • (1) Voir l’article “Les herpèsvirus équins : rôle majeur de l’herpèsvirus équin 1” de Pronost S et coll. et “Gestion d’un foyer de rhinopneumonie dans un foyer d’élevage” de Moreau P et coll., dans ce numéro.

  • (2) Voir l’article “Gestion d’un foyer de rhinopneumonie dans un foyer d’élevage” de Moreau P et coll., dans ce numéro.

Références

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Éléments à retenir

→ Un avortement peut être observé en présence d’une souche neuropathogène et une myélo-encéphalopathie en présence d’une souche non neuropathogène.

→ Le typage des deux types de souches d’herpèsvirus équin 1, neuropathogène et non neuropathogène, peut être réalisé par polymerase chain reaction.

→ La souche neuropathogène conduit à une virémie plus importante tant dans la durée que l’amplitude et augmente ainsi le risque accru de voir apparaître une forme nerveuse chez l’animal infecté.

→ Quelle que soit la souche détectée, il est essentiel de prendre les mesures d’hygiène pour limiter la contagion.

Encadré : Glossaire de biologie moléculaire

→ Génotype : le génotype est l’information portée par le génome du virus sous forme d’acide désoxyribonucléique (ADN). Dans la molécule d’ADN, c’est la séquence des nucléotides qui constitue l’information génétique. Dans cet article, la base en position 2254 peut présenter une mutation et sont alors évoqués les génotypes A2254 (forme sauvage) et G2254 (forme mutée).

→ Restriction Fragment Length Polymorphism ou RFLP : le polymorphisme de longueur des fragments de restriction est utilisé comme une caractéristique des molécules d’ADN permettant de les distinguer les unes des autres. En utilisant une ou plusieurs enzymes de restriction, le génome d’un individu va être découpé en plusieurs parties dépendant du nombre de sites de coupures présents dans le génome de l’individu pour l’(les) enzyme(s) utilisée(s). Le nombre de ces sites et leurs positions diffèrent en fonction de l’individu. Il existe donc un polymorphisme de longueur des brins coupés (fragments de restriction), et le profil d’un individu peut être réalisé grâce à cette méthode.

→ SNP : le polymorphisme nucléotidique, ou polymorphisme d’un seul nucléotide (Single Nucleotide Polymorphism ou SNP), est, en génétique, la variation (polymorphisme) d’une seule paire de bases du génome, entre individus d’une même espèce. Dans cet article : la base en position 2254.

→ Mutagenèse dirigée : la mutagenèse dirigée est l’induction d’une ou de plusieurs mutations dans un génome, de façon précise et volontaire.

→ ORF : un cadre ouvert de lecture (en anglais Open Reading Frame, ou ORF) est une séquence d’ADN débutant par un codon d’initiation et se terminant par un codon-stop. Entre ces deux codons, la phase ouverte de lecture contient un certain nombre de codons codant potentiellement une protéine. Le génome d’HVE-1 est composé de 80 ORFs.

→ Séquençage Next Generation Sequencing ou NGS : le séquençage de nouvelle génération est une nouvelle méthodologie de séquençage des génomes qui permet un séquençage à très haut débit.

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