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Article de synthèse
Auteur(s) : Peggy Moreau
Fonctions : DMV, ACVIM
Clinique équine
61500 Chailloué
Les analyses de crottins sont une aide précieuse dans la gestion diagnostique et thérapeutique des diarrhées chez le cheval. Mais elles ne sont pas infaillibles et leurs limites doivent être connues.
Les examens des crottins lors de diarrhée ont une importance diagnostique pour cibler le traitement, lorsque c’est possible, mais aussi d’un point de vue sanitaire en cas de maladies contagieuses. Les tests de laboratoire disponibles sont des cultures bactériologiques, des coproscopies, des analyses de biologie moléculaire (par exemple, la réaction en chaîne par polymérase ou PCR) ou immunologiques (comme l’immunofluorescence ou le test Elisa, pour enzyme-linked immunosorbent assay). Aucun test diagnostique n’est fiable à 100 %, chacun ayant ses limites, avec des faux négatifs et des faux positifs qui rendent l’interprétation des résultats délicate.
La connaissance des caractéristiques de chaque test (sensibilité et spécificité), si elles sont disponibles, est une aide pour interpréter de façon critique le résultat (encadré). De même, il est important d’avoir une idée de la prévalence de la maladie dans une population donnée car les résultats d’un test sont variables en fonction de la prévalence. Par exemple, si une affection est extrêmement rare dans une population, un test, même avec une bonne sensibilité, ne détecte pas les malades de façon fiable. Les valeurs prédictives d’un examen varient en fonction de la prévalence de la maladie [20].
L’objectif de cet article est de discuter des différentes techniques diagnostiques réalisables sur les prélèvements de crottins chez les chevaux en diarrhée. Les tests seront abordés par agent étiologique (tableau).
L’isolement bactérien est le meilleur moyen pour confirmer une salmonellose. Les cultures fécales pour la détection de Salmonella sont peu standardisées et varient entre les laboratoires [27]. Grâce à l’utilisation de milieux d’enrichissement et de multiples milieux de culture spécifiques, les cultures bactériennes de salmonelles sont relativement sensibles (photo 1) [9]. Cependant, les faux négatifs sont fréquents lorsque la concentration de Salmonella dans les crottins est faible [27]. Chez les chevaux en diarrhée aiguë secondaire à une salmonellose, la quantité de Salmonella dans les crottins est souvent élevée, donc les chances d’isolements positifs sont augmentées. Il est recommandé de collecter au moins trois à cinq crottins (12 à 24 heures entre les prélèvements) pour augmenter la sensibilité [8]. Au moins 1 g de fèces est nécessaire pour la culture bactériologique, idéalement, 5 à 10 g doivent être soumis au laboratoire [8, 27]. En raison, des différentes étapes d’enrichissement, la détection en culture de Salmonella peut prendre une semaine ou plus, surtout lorsque la bactérie est excrétée à de faibles concentrations [27].
L’isolement bactérien permet de déterminer le sérotype et d’effectuer une recherche épidémiologique [27].
Les techniques de biologie moléculaire sont une aide au diagnostic de salmonellose. La PCR permet de détecter la présence des gènes spécifiques de Salmonella. Elle augmente la rapidité de détection, comparée aux méthodes de bactériologie traditionnelle [27]. La sensibilité de la technique est très bonne (100 %) [28]. De nombreux gènes spécifiques sont ciblés. Cependant, des études comparatives ont démontré que certains gènes amplifiés ne sont pas complètement spécifiques (spécificité de 39 à 85 %), et que des faux positifs sont donc possibles [28]. D’après des études récentes, la sensibilité de la RT-PCR est de 100 % et la spécificité, de 98 % [14, 21]. Comme toutes les techniques PCR, des faux positifs peuvent résulter d’une contamination de laboratoire. La culture doit donc toujours être associée à la PCR. En effet, un test PCR positif associé à une culture négative doit être interprété avec précaution en raison de ces faux positifs [27].
Une suspicion de salmonelles est envisagée chez tout cheval en diarrhée, et d’autant plus s’il présente une hyperthermie et/ou une neutropénie. Dans ce cas, il convient d’associer la PCR, pour sa rapidité et son excellente sensibilité, et des cultures fécales, pour le diagnostic de confirmation.
Lors de diarrhée à Clostridium, un nombre important de bactéries à Gram positif en forme de bâtonnet peuvent être observées avec une coloration de Gram sur fèces, mais celle-ci ne permet pas d’établir un diagnostic (photo 2).
Les signes cliniques de la maladie étant dus aux toxines produites par Clostridium difficile, le diagnostic requiert l’identification de C. difficile toxinogène, c’est-à-dire de la bactérie qui produit des toxines (toxines A et/ou B) ou des toxines elles-mêmes.
La culture bactérienne de C. difficile seule n’est pas diagnostique, car certains C. difficile ne sont pas toxinogènes. En effet, toutes les souches de C. difficile ne produisent pas de toxines. Ainsi, 13 % des isolats chez le cheval sont non pathogènes [10]. La culture doit être associée à la détection des toxines A et/ou B ou des gènes de toxine. De plus, la culture de C. difficile est fastidieuse. Elle nécessite des conditions anaérobies et les prélèvements doivent être acheminés immédiatement au laboratoire sur glace pour obtenir une croissance [29].
La culture peut être associée à une PCR pour l’identification des gènes produisant des toxines. Cependant, la valeur diagnostique reste questionnable si la toxine en elle-même n’est pas identifiée dans les crottins [29]. La sensibilité et la spécificité de la PCR ne sont pas connues chez le cheval. Chez l’homme, la sensibilité varie de 80 à 100 % et la spécificité de 93 à 99 % [25].
Le “gold standard” pour diagnostiquer C. difficile est la mise en évidence de la toxine B dans les crottins par un test de cytotoxicité. Cependant, ce dernier est long, coûteux et non disponible en laboratoire [12, 19].
Différentes analyses immunologiques sont utilisées chez l’homme avec une sensibilité de 65 à 100 % et une spécificité de 70 à 100 % [1, 24]. Un test commercial Elisa(1) qui permet d’identifier les toxines A et/ou B dans les crottins a été validé chez le cheval. Il est à la fois rapide, sensible (84 %) et spécifique (96 %) [29].
Le diagnostic d’entérite à Clostridium perfringens est plus délicat car C. perfringens est un organisme commensal qui peut être isolé chez des animaux sains ou en diarrhée pour d’autres causes [29].
Ainsi, la culture seule ne permet pas d’établir le diagnostic. La détection des toxines spécifiques de C. perfringens est la méthode diagnostique de choix. Les toxines peuvent être identifiées par inoculation de crottins à des souris [17]. L’entérotoxine est détectable par deux types d’examen, soit un Elisa, soit un test d’agglutination passive inversé du latex(2)(3). L’Elisa est le plus souvent utilisé. Il n’existe pas d’étude de sensibilité et de spécificité chez le cheval, mais, chez l’homme, la sensibilité rapportée est faible et la spécificité est élevée [5, 29]. Pour la recherche de toxines, le prélèvement doit être envoyé au laboratoire immédiatement et transporté sur glace en raison de la labilité rapide de celles-ci.
Les gènes codant pour les toxines de Clostridium peuvent être amplifiés et identifiés par PCR. Toutes les souches de C. perfringens contiennent une alphatoxine. Les types sont ensuite identifiés par les gènes de toxines additionnels [17].
Un syndrome de rhodococcose intestinale à l’origine d’une nécrose et d’une ulcération du cæcum et du côlon peut être rencontré chez les poulains infectés par Rhodococcus equi. Le diagnostic de colite ulcérative à R. equi est difficile à établir car la bactérie est fréquemment retrouvée chez des chevaux adultes et des poulains asymptomatiques [20]. Le diagnostic d’entérite à R. equi peut être suspecté chez des poulains atteints de pneumonie à R. equi (diagnostiquée par culture sur un lavage trachéal) associée à des signes gastro-intestinaux [3]. Des techniques de PCR ont été mises en place pour le diagnostic de rhodococcose. Cependant, la PCR fécale ne présente que peu d’intérêt pour le diagnostic de la maladie car la bactérie est retrouvée dans l’environnement, dans les crottins des chevaux adultes et dans ceux de la plupart des poulains (sains ou malades) âgés de plus de 1 mois [26].
L’entérite proliférative peut être diagnostiquée ante-mortem grâce à l’identification de Lawsonia intracellularis par PCR dans les fèces. Chez le cochon, des infections expérimentales ont relevé une sensibilité de 36 à 67 % pour la PCR et de 90 à 91 % pour la sérologie, les deux techniques étant hautement spécifiques (100 %) [2]. De telles études n’ont pas été réalisées chez le poulain. Cependant, d’après les cas cliniques rapportés, la sensibilité de la sérologie semble également meilleure à celle de la PCR chez les poulains infectés [16]. De plus, l’excrétion fécale de L. intracellularis s’arrête rapidement dès l’instauration du traitement par antibiotiques (érythromycine), et la PCR n’est donc pas une technique diagnostique appropriée après l’initiation d’une antibiothérapie adaptée [2, 3, 15].
Une cause majeure de diarrhées aiguës secondaires au parasitisme est le désenkystement des larves de cyathostomes [16]. Cependant, le parasitisme aux cyathostomes, aux grands strongles et aux anaplocéphales peut, dans certains cas, provoquer des diarrhées chroniques [16].
L’infestation par les strongles peut être mise en évidence par la détection des œufs dans les crottins par coproscopie. Des méthodes de flottaison utilisant des solutions salées saturées, sucrées ou du sulfate de zinc sont qualitatives, d’autres sont quantitatives (cellule de McMaster, technique de Wisconsin modifiée, méthode de Stoll modifiée). Les œufs sont allongés avec les extrémités arrondies, leur paroi est mince, et ils contiennent un embryon multicellulaire (de 8 à des centaines) de couleur brunâtre (photo 3). Quelle que soit la méthode utilisée, l’interprétation est délicate car le nombre d’œufs de strongles observés n’est pas corrélé avec celui de parasites internes, donc ne permet pas de prédire le parasitisme clinique. Les œufs de grands strongles ne sont pas facilement différenciables des œufs de cyathostomes. Lors d’infection mixte, plus de 95 % des œufs sont produits par les cyathostomes. L’inconvénient majeur de la coproscopie est que les formes larvaires en migration des grands strongles et les larves enkystées de cyathostomes, qui sont pathogènes, ne sont pas identifiées [7, 23]. Lors de cyathostominose, les œufs sont généralement absents et le raclage de la muqueuse intestinale par fouille rectale peut permettre d’observer des vers d’environ 1 cm de long. Une espèce, Trichonema, est particulièrement facile à repérer à cause de sa couleur rouge orangé (photo 4). Si elle est présente, plusieurs autres espèces, moins facilement visibles, peuvent l’être également.
Si la proportion précise d’œufs de grands strongles et de cyathostomes est recherchée, une culture fécale est réalisée en cultivant les crottins pendant 10 à 14 jours jusqu’à obtenir les larves L3, alors différenciables [7, 22].
Des techniques moléculaires fondées sur la PCR sont actuellement en cours de développement pour détecter et quantifier les œufs de grands et de petits strongles dans les crottins, mais ne sont pas encore commercialisées [7, 22].
Strongyloides westeri peut être à l’origine d’une diarrhée chez les poulains pendant les 2 premiers mois de vie. L’infestation à S. westeri est diagnostiquée par la présence de petits œufs ovales contenant une larve enroulée visible à la coproscopie (photo 5). Cependant, l’observation d’œufs de S. westeri n’implique pas toujours que le parasite est la cause de la diarrhée. Une étude a rapporté que leur présence est corrélée avec des diarrhées seulement lorsque le comptage est supérieur à 2 000 œufs/g [22].
Bien que les anaplocéphales soient le plus souvent à l’origine de coliques, des cas de diarrhées intermittentes ont aussi été décrits. Les œufs peuvent être observés par coproscopie. Cependant, les techniques de flottaison sous-estiment le nombre de chevaux réellement infestés. Des méthodes de double centrifugation permettent d’augmenter le nombre d’œufs détectés. Quel que soit le test utilisé, la sensibilité reste basse en raison de l’excrétion intermittente des œufs, et il n’existe aucune corrélation entre le nombre de cestodes adultes et le nombre d’œufs [13].
Chez le poulain, le rôle de Cryptosporidium parvum dans les diarrhées est controversé. 15 à 31 % des poulains sont infectés, et Cryptosporidium doit être considéré comme pathogène en particulier chez les jeunes compromis qui sont hospitalisés.
Les oocystes de Cryptosporidium sont très petits et difficiles à identifier par les méthodes de flottaison habituelles. La centrifugation dans le sulfate de zinc permet de concentrer les parasites, puis une goutte de sucre est ajoutée sur la lame de microscope. Les oocystes apparaissent alors dans la solution de sucrose comme de petites structures rondes à cytoplasme rosé contenant quelques granules foncés (photo 6). La détection d’oocystes de Cryptosporidium dans les crottins peut aussi être favorisée par une coloration de Ziehl-Neelsen. Cette dernière est très sensible mais peu spécifique. Des techniques d’immunofluorescence ou de cytométrie de flux permettent aussi d’identifier les oocystes [7, 22, 23].
Eimeria leukarti est fréquemment identifié dans les fèces par flottaison fécale standard chez les foals âgés de 30 à 125 jours, mais ne semble pas être une cause de diarrhée chez le poulain [18, 23]. L’oocyste est très lourd et la sédimentation serait la technique la plus sensible. Toutefois, ces parasites peuvent aussi être observés après centrifugation dans une solution saturée de sucre.
L’oocyste est de forme ovale, aplati dans sa partie étroite, sa paroi est épaisse avec un micropyle (ouverture) distinct. Sa couleur est d’un brun très foncé, presque opaque (photo 7) [18, 23].
Des Giardia peuvent être trouvés par coproscopie chez des poulains normaux (17 à 35 %). La maladie doit être suspectée chez le poulain ou le cheval adulte si un très grand nombre de parasites sont identifiés dans les matières fécales, associés à des signes cliniques de diarrhée intermittente. [18, 23].
Les rotavirus atteignent les poulains âgés de 2 jours à 5 mois. La détection des particules virales dans les fèces par microscopie électronique est considérée comme le “gold standard” pour le diagnostic des rotavirus, mais ce test n’est pas facilement faisable en routine, car il est coûteux et long. Les Rotavirus croissent très difficilement en culture, et l’isolement n’est donc pas un examen diagnostique applicable.
Les tests commerciaux pour le diagnostic des rotavirus sont fondés sur la détection de VP6, une protéine virale abondante et hautement conservée entre les différentes souches. Un prélèvement fécal (1 à 3 g) peut être soumis pour une agglutination au latex(4) ou un Elisa(5). Si le prélèvement est adressé au laboratoire dans les 8 heures, il est possible de le conserver à température ambiante ou de le réfrigérer. Sinon, il convient de contacter le laboratoire pour les conditions de stockage et d’envoi. Pour les kits des tests d’agglutination au latex, le résultat est disponible en 10 à 15 minutes, avec une sensibilité de 86 à 100 % et une spécificité de 95 à 96,3 % [4]. Comparé à la microscopie électronique, l’Elisa a une sensibilité de 91 % et une spécificité de 98 % [6]. D’autres méthodes utilisant les prélèvements de crottins existent pour diagnostiquer les rotaviroses, incluant l’électrophorèse, la PCR et des techniques moléculaires [4].
L’apparence macroscopique (consistance, couleur, odeur, sang) de la diarrhée apporte aussi des informations. Cependant, elles restent limitées.
La présence de sang frais dans les crottins suggère un saignement de la muqueuse du côlon distalement [9]. Le sang occulte peut être détecté par des dispositifs qualitatifs (Hematest®(6) et Succeed®(7)). Pour le premier, de nombreux faux positifs et faux négatifs existent. Le second, commercialisé récemment, détecte à la fois la présence d’albumine et/ou la présence d’hémoglobine, permettant de distinguer approximativement l’origine des saignements (saignements hauts ou du côlon). La sensibilité et la spécificité publiées par le laboratoire sont respectivement de 75 à 83 % et de 73 à 87 %.
Les entérites dues au sable peuvent être diagnostiquées par un test simple et facilement réalisable sur le terrain en mettant des crottins dans un gant de fouille et en ajoutant de l’eau. Lorsque du sable est présent dans ceux-ci, il sédimente et une sensation granuleuse est palpable au bout des doigts du gant (photo 8). Les chevaux sains peuvent présenter une petite quantité de sable dans les crottins. De 0,5 à 1 cm de sable accumulé est considéré comme significatif.
La connaissance critique des différents tests disponibles est une aide au diagnostic étiologique des diarrhées, et permet de cibler le traitement et de mettre en place les éventuelles mesures sanitaires nécessaires. Toutefois, malgré toutes ces analyses, de nombreux cas de diarrhées restent d’origine indéterminée et relèvent d’une gestion symptomatique [11].
(1) C. difficile TOX A/B II Elisa, TechLab Inc, Blacksburg, VA, États-Unis.
(2) C. perfringens enterotoxin test, TechLab Inc, Blacksburg, VA, États-Unis.
(3) C. perfringens enterotoxin kit, Oxoid division, Unipath, Ogdensburg, NY, États-Unis.
(4) Virogen Rotatest, Wampole Laboratories, Cranbury, NJ, États-Unis.
(5) Rotazyme, Abbott Laboratories, North Chicago, IL, États-Unis.
(6) Bayer diagnostics, Puteaux Cedex, France.
(7) Freedom Health, Aurora, OH, États-Unis.
• Les analyses de prélèvements de crottins sont un geste essentiel lors de diarrhée chez le cheval.
• L’existence de faux positifs et de faux négatifs peut rendre délicate l’interprétation des tests.
• La connaissance des limites des différents examens disponibles permet de choisir les analyses les plus pertinentes dans un cas précis.
• La connaissance de la prévalence de la maladie recherchée dans la population accroît la fiabilité de l’interprétation des tests.
• La sensibilité d’un test est définie comme la proportion d’animaux infectés correctement identifiés comme tels.
• La spécificité est définie comme la proportion d’animaux non infectés identifiés comme tels.
• La sensibilité et la spécificité d’un examen sont comparées au test considéré comme le “gold standard” pour le diagnostic d’une maladie. Pour les analyses quantitatives, une valeur seuil doit être déterminée afin de les évaluer.
• Les valeurs prédictives sont calculées comme la proportion de chevaux réellement infectés parmi les animaux positifs (valeur prédictive positive) et comme la proportion de chevaux réellement non infectés parmi les animaux négatifs (valeur prédictive négative). Elles varient en fonction de la prévalence de la maladie dans la population [13].
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