Quels examens en bactériologie chez le cheval ?

L’examen bactériologique est une étape nécessaire, avant tout traitement antibiotique, pour confirmer ou infirmer un diagnostic dans les cas de maladies infectieuses chez le cheval. La pertinence des résultats dépend de la qualité du prélèvement effectué et des conditions de son acheminement. Leur interprétation est fonction des bactéries isolées, de leur abondance au sein de l’échantillon ainsi que des commémoratifs cliniques.

L’objet de cet article est de présenter les différents types d’examens complémentaires qui sont à la disposition des vétérinaires dans leur démarche diagnostique.

La recherche de bactéries peut se dérouler par des méthodes :

– directes : mise en évidence de bactéries, de leurs antigènes ou d’acides nucléiques spécifiques (^{figure 1}) ;

– indirectes (techniques d’immunologie par détection d’anticorps spécifiques de l’agent pathogène). Ces dernières ne sont pas abordées dans cet article.

Examen microscopique

L’examen microscopique est effectué à partir de prélèvements cliniques, préalablement fixés sur une lame. Différentes colorations peuvent alors être réalisées.

La coloration de Gram est une coloration de référence en bactériologie. Elle permet de différencier deux grandes catégories de bactéries, celles à Gram positif, colorées en violet, et celles à Gram négatif, colorées en rose. Cette coloration permet d’observer la taille, la forme et le mode de groupement caractéristique de certaines familles de bactéries. Ainsi, les streptocoques, coques à Gram positif, sont assemblés en chaînettes (^photo.1). Dermatophilus congolensis, coques à Gram positif, se présentent assemblés en échelle ou rails de chemin de fer (^{photo 2}).

Cet examen rapide permet d’établir une liste possible d’agents étiologiques et de mettre en place précocement une antibiothérapie probabiliste, dans l’attente de résultats de l’antibiogramme.

D’autres types de colorations existent. Par exemple, la coloration de Ziehl-Neelsen permet la mise en évidence de bacilles acido-alcoolorésistants tels que les mycobactéries, alors que la coloration de Stamp est utilisée pour révéler les éléments de type Chlamydiae dans le cytoplasme des cellules infectées.

L’examen microscopique s’applique également à la recherche d’antigènes bactériens par des techniques telles que l’immunofluorescence. Des anticorps spécifiques d’un antigène bactérien sont utilisés pour repérer ce dernier dans un prélèvement préalablement étalé sur lame. Chez le cheval, cette technique est employée pour la recherche de Taylorella equigenitalis, agent responsable de la métrite contagieuse équine, dans les prélèvements génitaux (^{photo 3}).

Mise en culture du prélèvement

Les bactéries les plus fréquemment rencontrées en médecine vétérinaire ont la capacité de se développer sur des milieux de culture. Ces derniers sont indispensables à leur multiplication, ce qui permet par la suite une identification bactérienne, ainsi que l’étude de la sensibilité aux antibiotiques lorsque la bactérie est isolée en culture pure.

La mise en culture du prélèvement peut se dérouler sur différents types de milieux, qui varient selon la bactérie recherchée, la nature du prélèvement et/ou les commémoratifs cliniques (encadré). Il est donc primordial de bien renseigner la demande d’analyses afin que les recherches soient correctement orientées et que les milieux et/ou les conditions d’incubation spécifiques à certaines bactéries soient appliqués. Ces milieux sont généralement incubés à 37 °C pendant 24 heures au minimum, en aérobiose et/ou en anaérobiose selon les bactéries recherchées.

Les identifications (à l’aide de tests morphologiques, biochimiques, culturaux), ainsi que les antibiogrammes sont réalisés à partir de cultures bactériennes pures. Les souches pures peuvent être conservées pour réaliser des suivis épidémiologiques ou des autovaccins. Le délai moyen pour obtenir un résultat bactériologique est de 48 heures à 72 heures pour des bactéries classiques. Il convient de compter 21 jours pour les mycoplasmes et jusqu’à 10 semaines pour les mycobactéries.

Techniques de biologie moléculaire

Les techniques de biologie moléculaire, et notamment la polymerase chain reaction (PCR), de plus en plus utilisées lors des examens complémentaires chez le cheval, consistent à mettre en évidence des séquences d’acides nucléiques (ADN ou ARN) spécifiques d’un ou de plusieurs gènes présents au sein de la bactérie recherchée.

Les PCR dites classiques sont constituées de trois étapes : extraction d’acides nucléiques, amplification à l’aide d’amorces spécifiques et séparation par électrophorèse des produits amplifiés. Le fragment d’ADN caractéristique est ensuite visualisé par coloration au bromure d’éthidium (^{photo 4}). Ces techniques sont de plus en plus remplacées par des PCR en temps réel où l’amplification des gènes cibles peut être visualisée et quantifiée grâce à des sondes marquées (^{figure 2}).

Les techniques de PCR permettent de détecter des bactéries directement à partir des prélèvements cliniques. Elles ont profondément bouleversé le diagnostic des maladies infectieuses dans les laboratoires de bactériologie, notamment là où les méthodes classiques de culture rencontrent leurs limites : lorsque les bactéries sont peu abondantes, difficiles à cultiver (bactéries intracellulaires comme Lawsonia intracellularis, leptospires pathogènes dans l’humeur aqueuse ou vitrée, etc.), ou à croissance très lente (mycobactéries).

Elles permettent également, à partir d’une culture bactérienne, de confirmer le caractère pathogène ou non d’une bactérie (par exemple, mise en évidence du facteur de virulence chez Rhodococcus equi par la recherche du gène VapA ou des gènes codant pour les toxines de Clostridium difficile, de Clostridium perfringens et d’Escherichia coli).

Dans certains cas, des difficultés d’interprétation du résultat d’analyse par PCR apparaissent, car cette technique peut aussi amplifier des fragments d’ADN de bactéries contaminantes, et ne différencie pas les bactéries mortes des vivantes. Des.acides nucléiques au sein d’un prélèvement doivent donc être systématiquement interprétés selon le contexte clinique (commémoratifs, type de prélèvement, contexte épidémiologique, etc.).

L’inconvénient majeur de cette technique est l’absence d’isolement de souches, donc l’impossibilité de réaliser un antibiogramme et/ou un autovaccin lorsqu’une bactérie pathogène est mise en évidence (salmonelle, Rhodococcus equi, etc.). :