Le clonage dans l’espèce équine : état des lieux et perspectives d’avenir

La technique du clonage est à présent maîtrisée chez le cheval, avec cependant une faible efficacité globale.

Le clonage consiste à reproduire des organismes vivants pour obtenir des êtres génétiquement identiques. Il peut s’appliquer à de simples cellules (clonage cellulaire) ou bien à des végétaux et à des animaux (clonage reproductif). L’ensemble de ces cellules, ou individus, forme un seul et même clone au patrimoine génétique identique entre eux et à celui du “modèle”. Les premières expériences de clonage sur des œufs d’oursin remontent à la fin du XIX^e siècle. C’est seulement en 1984 que naissent les premiers équidés clonés par la technique de clonage la plus ancienne : la bissection embryonnaire. Cet article se propose de faire le point sur l’avancée de cette biotechnologie dans l’espèce équine.

Différentes techniques de clonage

Méthodes du passé

Assez peu utilisées chez le cheval, les différentes techniques de clonage permettent uniquement de créer des individus identiques à partir d’un embryon.

Bissection embryonnaire

La bissection embryonnaire permet d’obtenir des individus identiques en divisant un embryon en plusieurs morceaux [¹, ²⁸, ²⁹]. Le principe est relativement simple : l’embryon est récolté aux stades morula ou jeune blastocyste, et découpé en deux ou en quatre à l’aide de micro-instruments. Les demi-embryons obtenus sont cultivés in vitro avant d’être réimplantés dans l’utérus de juments receveuses. Le taux de gestation obtenu varie de 22,7 à 67 % [²⁸, ³³]. Sur les dix gestations obtenues par Allen et Pashen, six sont parvenues à leur terme et ont donné naissance à des poulains vivants [¹]. La bissection embryonnaire permet ainsi d’augmenter le nombre d’embryons par femelle et de créer des jumeaux. Cependant, trois limites majeures persistent. Tout d’abord, le nombre d’individus identiques obtenus est limité, puisque deux sections au maximum de l’embryon peuvent être réalisées, conduisant à la production de quatre individus par embryon. Ensuite, cette technique permet de créer des individus identiques entre eux à partir d’un embryon, produit d’un mixage de gènes paternels et maternels. Enfin, la bissection a été essentiellement pratiquée chez de jeunes embryons équins dépourvus de capsule, mais leur récolte est compliquée puisque le prélèvement s’effectue soit par lavage précoce des trompes utérines, soit par méthode chirurgicale, ce qui limite l’emploi de cette méthode à des études expérimentales. Cependant, l’équipe de Skidmore a obtenu en 1989 trois gestations en coupant des embryons équins capsulés [³³].

Transfert nucléaire de cellules embryonnaires

Le transfert nucléaire de cellules embryonnaires utilise deux populations cellulaires différentes : d’une part, des ovocytes dont est extrait l’ensemble du matériel génétique et, d’autre part, des embryons dont sont prélevés les blastomères, cellules embryonnaires totipotentes. L’étape de transfert nucléaire consiste dans un premier temps à injecter une cellule embryonnaire dans l’espace périvitellin d’un ovocyte énucléé, puis à faire fusionner ces deux cellules. Enfin, une étape d’activation de l’ovocyte permet d’initier le développement du nouvel embryon. Cette technique présente l’avantage d’obtenir, à partir d’un embryon, plusieurs embryons possédant le même matériel génétique. Elle a été utilisée avec succès chez la vache (10 à 36,4 % de naissances), mais aucune publication ne fait état d’essais de clonage par transfert de blastomères embryonnaires chez le cheval.

Clonage moderne : le transfert nucléaire de cellules somatiques

En 1997, la naissance de Dolly révolutionne le monde scientifique [³⁸]. En effet, l’équipe de chercheurs du Roslin Institute vient de créer le clone d’une brebis âgée de 6 ans en utilisant une cellule de sa glande mammaire. Ils ont donc employé une cellule différenciée pour faire un nouvel individu complet et en bonne santé. Une cellule somatique différenciée peut donc être génétiquement reprogrammée vers un état indifférencié, comparable à un zygote au stade “1 cellule”. Elle peut alors initier et supporter un développement embryonnaire et fœtal normal, donnant naissance à un individu génétiquement identique au “donneur de cellules”.

Le clonage somatique repose sur un ensemble d’étapes précises, plus ou moins délicates (^{figure 1}). Dans un premier temps, des ovocytes sont récoltés sur des ovaires de juments. Ils sont ensuite soit mis en maturation in vitro pour les amener au même stade de développement nucléaire (stade métaphase II), soit utilisés directement s’ils sont matures [³⁵]. Enfin, ils sont énucléés. Ils constituent les cellules dites “receveuses de noyau” ou ovoplastes. Parallèlement, des cellules du cheval qui doit être cloné sont prélevées, mises en culture et conservées par congélation dans de l’azote liquide jusqu’à leur utilisation : ce sont les cellules dites “donneuses de noyau” [¹⁹, ²², ²³, ²⁴, ²⁵]. Différentes populations cellulaires peuvent être employées, mais le fibroblaste est la cellule la plus pratique puisque le prélèvement s’effectue par simple biopsie dermique. Cette dernière peut être pratiquée à l’écurie par le vétérinaire. Le praticien prélève deux ou trois morceaux de tissu sous-cutané qu’il place dans des tubes contenant un milieu de culture à + 4 °C [¹⁶].

Ensuite, les deux cellules sont fusionnées. Il s’agit de l’étape spécifique du clonage : le transfert nucléaire, transfert du matériel génétique d’une cellule dans le cytoplasme d’un ovocyte énucléé (^{photo 1}). L’ovocyte recombiné, qui contient désormais le matériel génétique de la cellule donneuse, est ensuite activé pour initier le développement embryonnaire [⁵, ⁶, ⁷, ⁸]. Les résultats de cette étape essentielle du clonage sont médiocres : il s’agit donc d’un des points noirs de cette technique. Deux difficultés sont responsables des échecs de développement. D’abord, la réactivation de l’ovocyte, normalement assurée par l’entrée du spermatozoïde, puis la reprogrammation génétique du noyau inséré pour le ramener à l’état totipotent.

L’embryon est ensuite soit transféré immédiatement, au stade “1 cellule”, dans l’oviducte d’une jument receveuse (méthode chirurgicale), soit cultivé in vitro avant d’être transplanté à un stade plus avancé (blastocyste) [⁸, ¹⁸, ²¹, ³⁵, ³⁹]. Dans les deux cas, le cycle de la jument receveuse est synchronisé avec le stade de développement de l’embryon qu’elle va recevoir.

Au fil du temps, les techniques de clonage ont évolué et permettent aujourd’hui de reproduire un individu vivant à l’identique, en utilisant des cellules parfaitement différenciées. Certaines étapes du clonage somatique sont délicates, tantôt par leur faible efficacité, tantôt pour la minutie et la précision qu’elles requièrent (^{tableau 1}). De nombreuses études sont encore nécessaires pour comprendre les mécanismes mis en jeu et améliorer l’efficacité globale du clonage somatique, nécessaire à son acceptation sociale mais aussi à sa plus grande utilisation. Les difficultés du développement in vivo de ces embryons clonés “construits” in vitro sont maintenant à envisager.

Cheval cloné : de sa conception à l’âge adulte

Le clonage des chevaux s’étant développé très récemment et le nombre de poulains obtenus étant très faible, les données sur la santé du poulain cloné sont pauvres. À l’heure actuelle, entre 30 et 40 poulains clonés sont nés vivants et les plus âgés ont 4 ans [³⁰]. Ils doivent faire l’objet d’un suivi à plus long terme.

Vie embryonnaire et fœtale du clone

Cette période est la plus risquée. En effet, les pertes sont nombreuses au cours de la gestation et leur origine est souvent inconnue.

Une fois que l’embryon a été transplanté, la jument est suivie très régulièrement. L’échographie transrectale permet de réaliser un diagnostic de gestation précoce. Le taux de gestation obtenu après transfert embryonnaire varie de 9 % à plus de 60 % selon les expériences, mais, en général, le nombre de diagnostics précoces de gestation positifs reste faible (^{tableau 2}). Ensuite, la croissance de l’embryon doit être suivie. Certaines équipes relèvent des anomalies de développement courantes, comme une vésicule embryonnaire de petite taille par rapport à son âge, l’absence de bouton embryonnaire dans la vésicule ou celle de battement cardiaque [³⁵, ³⁶, ³⁷, ³⁹]. Jusqu’en 2004, 75 à 100 % des gestations établies se concluaient par un avortement, la plupart au tout début de la gestation. Mais l’évolution de la technique de clonage a permis, dans les années suivantes, de diminuer ce taux d’avortements, qui varie ensuite entre 44 et 80 %.

Enfin, lorsque la gestation est plus avancée, l’échographie permet d’observer les avortements et de détecter les anomalies placentaires associées. Quelques avortements tardifs ont permis de réaliser des observations macroscopiques du placenta et de l’avorton. Les anomalies décelées sont relativement mineures : cordon ombilical œdématié et nodules de nécrose dans le foie, structure kystique remplie de liquide allantoïdien dans le cordon ombilical et petite zone placentaire dépourvue de villosité avec, cependant, un fœtus normal [¹⁸, ²¹].

Les pertes gestationnelles apparaissent aussi importantes que dans les autres espèces, mais moins spectaculaires. En effet, la faible gravité des anomalies observées chez les équidés est assez surprenante comparées aux affections placentaires fréquentes et sévères observées chez les ruminants : hydrallantoïde, œdème placentaire ou hydropisie des enveloppes fœtales [⁴, ²⁶].

De même, pour la croissance du fœtus, une différence majeure existe entre les ruminants et les équidés. En effet, une anomalie de développement nommé “syndrome du gros veau”, caractérisé par un poids et une taille du fœtus augmentés, est décrit chez les ruminants, tandis qu’il n’a jusqu’à maintenant pas été observé chez les équidés. Seule l’équipe d’Hinrichs a observé un fœtus présentant un réel retard de croissance qui a induit un allongement de la durée de gestation et la naissance d’un poulain léger (27 kg) [¹⁸].

Naissance du poulain cloné

Le poulinage se déroule normalement : la préparation de la jument est identique, la naissance se réalise naturellement et le plus souvent sans assistance au terme d’une gestation de durée comparable à celle déterminée pour des gestations classiques (de 329 à 389 jours, moyenne de 346 jours) [¹³, ¹⁸, ²¹, ⁴⁰]. Seul un poulain a largement dépassé le terme (389 jours de gestation).

À ce jour, une quarantaine d’équidés clonés sont nés (^{figure 2} et ^{photo 2}). Le comportement du poulain cloné, dans les quelques heures qui suivent sa naissance, ne semble pas différent de celui d’un poulain non cloné : il se lève dans les 30 minutes et tète généralement dans les 2 heures [¹⁸, ²¹]. Immédiatement après la naissance, les poulains sont pesés et subissent un examen physique complet. Aucun problème de poids ni de taille n’est remarqué. Seule l’équipe américaine d’Hinrichs a obtenu un poulain un peu léger [¹⁸]. Une fois de plus, le cheval ne suit pas le modèle présenté par les ruminants puisque, pour eux, le syndrome du gros veau, caractérisé par un poids et une taille du fœtus augmentés et associé à des anomalies placentaires graves, est fréquemment observé à la naissance. L’examen du poulain cloné ne révèle donc pas d’anomalie majeure [¹³, ¹⁵, ¹⁸, ²¹, ³⁶, ⁴⁰].

Après la naissance d’animaux clonés, l’examen des annexes fœtales est encore plus approfondi et les équipes cherchent toute anomalie qui pourrait être à l’origine d’éventuelles maladies néonatales. Quelques malformations sans grande conséquence ont été relevées [¹⁸, ²¹, ⁴⁰]. Dans l’expérience des mules clonées, la corne non gravide est systématiquement plus longue que la corne gravide, et, sur l’un des placentas, des zones de nécrose légère, centrées sur les microcotylédons et microscopiquement associées à des modifications minimes de type inflammatoire (placentite lymphocytaire), sont observées [³⁶, ⁴⁰]. Dans une expérience d’Hinrichs, un cordon ombilical est légèrement élargi (2,7 cm de diamètre) et œdématié [¹⁸]. Pour les autres expériences de clonage réalisées, il n’existe pas de rapport présentant une anomalie grave de la placentation.

Clone : de l’enfance à l’âge adulte

En juillet 2006, sur les 16 naissances de poulains clonés enregistrées, 3 poulains n’ont pas survécu : l’un est mort de septicémie 40 heures post-partum, le deuxième de pneumonie 48 heures post-partum et le dernier de complications à la suite d’une anesthésie pour suturer une rupture vésicale (4 jours d’âge). Un clone de Calvaro V, né prématurément, a dû être euthanasié environ 1 mois après sa naissance, à la suite d’une arthrite septique sévère, ce qui correspond à 25 % de mortalité néonatale, résultat proche de celui des bovins [⁴]. Selon Hinrichs, 50 % des poulains clonés présentent des troubles de santé à la naissance qui nécessitent des soins [¹⁵]. Les plus fréquemment rencontrés sont des contractures tendineuses sur les antérieurs, une persistance des structures ombilicales avec une taille augmentée des éléments de l’ombilic (vaisseaux, etc.), qui peut nécessiter une ablation chirurgicale, et une faiblesse de certains nouveau– nés à la naissance ou des signes de maladaptation (encéphalopathie hypoxique) [¹⁸]. Une augmentation de l’incidence des déviations angulaires des membres chez les poulains, qui peuvent se corriger seules ou nécessiter la mise en place des thérapeutiques classiques, est également rapportée. Cliniquement, les trois mules clonées sont restées en bonne santé au cours de leur période néonatale et le sont toujours [⁴⁰]. Pieraz-Cryozootech-Stallion, Paris-Texas et E.T.-Cryozootech-Stallion ont également grandi sans incident (^{photos 3} et ⁴). Les poulains clonés, dont la naissance est publiée, semblent donc grandir correctement et être en bonne santé. Même si 50 % d’entre eux présentent une affection au cours de leur jeune âge, la faible gravité de celle-ci permet de maintenir en vie la majorité des animaux.

La question du vieillissement accéléré des clones a rapidement été posée. En effet, lorsque la cellule donneuse utilisée est un fibroblaste, celle-ci a subi, avant son utilisation dans le transfert nucléaire, un certain nombre de cycles cellulaires et a donc un “certain âge”. Grâce à des études réalisées dans de nombreuses espèces, différentes équipes de chercheurs ont définitivement écarté ce risque chez les clones. [²⁷, ³¹].

Une autre interrogation concerne la ressemblance entre le clone et son modèle, tant sur le plan physique que sur celui des compétences sportives. Le clone est-il la copie conforme de l’original ? Un certain nombre de facteurs vont empêcher cette ressemblance parfaite, mais deux seulement sont liés à la technique de clonage : le phénomène de reprogrammation nucléaire et le mélange de mitochondries (encadré 1). Enfin, l’environnement du poulain cloné, utérin puis extérieur, est impossible à reconstituer à l’identique. La gestion du jeune en matière d’alimentation et d’exercice, et plus tard son entraînement sportif sont autant de paramètres qui vont modifier la croissance, le phénotype, le tempérament et les aptitudes sportives du clone adulte.

Perspectives d’utilisation du clonage chez les équidés

Conservation et diffusion de génotypes équins d’intérêt

Clonage de chevaux de haute valeur génétique

• Dans le cas des hongres, l’objectif du clonage est de valoriser les animaux dont les performances sont exceptionnelles et pour lesquels, a posteriori, la castration est regrettée. Il s’agit de restaurer, au travers d’un clone entier, la capacité de reproduction de l’animal performeur. L’intérêt génétique de cette pratique a été démontré par Ricard [³²]. En effet, le clonage permet d’augmenter le progrès génétique dans le cas d’une proportion importante de hongres en compétition (plus de 40 % de la population mâle), ce qui est largement le cas chez les chevaux. Les généticiens conseillent d’utiliser les clones prioritairement comme reproducteurs pour éviter d’allonger l’intervalle entre générations. En effet, le temps nécessaire pour produire un clone pubère augmente l’intervalle entre les générations. Pour y trouver un bénéfice, il convient donc de réaliser un compromis entre augmentation de l’intensité de sélection et l’allongement de l’intervalle entre générations. Globalement, bon nombre d’éleveurs doutent de l’utilité de cloner un hongre et avancent les arguments suivants : le nombre élevé de reproducteurs mâles déjà sur le marché et le décalage entre les heures de gloire du hongre cloné et le début de la période de reproduction de son clone [²]. Cependant, le clonage des hongres performeurs représente la principale application à l’heure actuelle de cette technique.

• Pour les juments, deux possibilités sont envisageables : soit cloner une vieille jument pour la remplacer par son clone plus jeune, soit cloner une jument d’exception disparue subitement. Avec l’âge, la fertilité de la jument diminue, comme dans toute espèce animale. Il serait donc intéressant de pouvoir créer un clone des meilleures juments pour prolonger leur carrière de poulinière et, de cette façon, augmenter le nombre de descendants d’une même jument. Le clonage de juments fait l’objet de moins de réticences sur le terrain car il risque peu de mettre en péril la diversité génétique tant le nombre de poulains qu’une jument peut produire reste faible par rapport à celui de poulains que peut donner un étalon. Cependant, le clonage des femelles ne crée pas de progrès génétique et n’est pas plus avantageux que le transfert d’embryons dans l’amélioration de la connaissance de la valeur génétique des reproducteurs [³²].

• Le clonage d’un étalon performeur aurait pour effet de mettre à disposition des éleveurs de la semence de qualité, soit en plus grande quantité sur la période où les deux étalons seraient en activité simultanément, soit sur une durée plus longue si le clone prenait la suite de l’étalon cloné disparu. Dans le premier cas, un engorgement du marché avec des produits issus de la même génétique serait à craindre et, dans le second, le risque serait de voir l’étalon cloné “dépassé”, soit parce qu’il ne serait plus à la mode, soit parce que son niveau génétique aura été rattrapé par les autres reproducteurs, et notamment sa descendance. Le clonage d’étalons est loin de faire l’unanimité, les acteurs de la filière estimant qu’ils sont en nombre suffisant sur le marché, ainsi que les jeunes à tester [²]. Soulignons que si la carrière d’un étalon se prolonge trop, il se produit une diminution du progrès génétique car celui-ci dépend en partie de l’intervalle entre générations. En effet, au-delà de huit à dix saisons de reproduction, les étalons performeurs n’ont plus d’intérêt en termes de progrès génétique [³⁴].

• Mais le clone peut-il faire un bon reproducteur ? Dans le cas des juments, peu de données sont publiées sur les capacités reproductrices du clone et la santé de sa progéniture. Cependant, Prometea (premier clone de jument) a produit un poulain en 2008 (Pegaso), sans présenter de trouble de la fertilité. En ce qui concerne la génétique transmise par la jument clonée, une question se pose. En effet, nous avons vu plus haut que le clone diffère de son modèle car ses cellules contiennent un mélange de mitochondries, issu de l’ovoplaste pour une part et du fibroblaste pour l’autre. Donc, les ovocytes produits par la jument clonée contiennent également des mitochondries des deux types, et, au cours de la fécondation, elle va transmettre à l’embryon de l’ADN mitochondrial différent de celui de la jument modèle. La jument clonée transmet donc exactement le même matériel génétique nucléaire que la “vraie jument”, mais aussi un matériel génétique mitochondrial partiellement différent, sans que les effets de cette infime différence soient connus.

Dans le cas des mâles, les capacités reproductrices du clone et la santé de sa progéniture semblent bonnes. En effet, Pieraz-Cryozootech-Stallion possède un sperme fertile et comparable à celui d’un étalon de son âge. Les premières inséminations ont eu lieu en 2007, permettant la naissance en 2008 du premier produit d’un “étalon clone” : Pierazade du Vialaret, et du deuxième produit issu d’un clone (^{photo 5}). En ce qui concerne la génétique transmise par les clones reproducteurs mâles, la question de l’ADN mitochondrial ne se pose pas car celui-ci est présent dans la pièce intermédiaire du spermatozoïde qui ne pénètre pas dans l’ovocyte. L’ADN transmis par un clone mâle est donc strictement identique à celui en provenance de son modèle.

Le clonage ne semble donc pas perturber la fonction de reproduction des clones et leur large utilisation peut, de ce point de vue, s’effectuer sans crainte.

Création d’une banque de matériel génétique

Actuellement, il existe un programme de conservation des races avec congélation de spermes, d’ovocytes et d’embryons (cryobanque). Cette banque pourrait être complétée par des cellules différenciées pour pouvoir réaliser le clonage somatique d’une race en voie de disparition (cheval sauvage de Przewalski). Ce système de banque de cellules somatiques est déjà développé pour les animaux de rente et c’est un service que propose la société Cryozootech pour les chevaux. Le propriétaire d’un cheval de valeur peut faire pratiquer une biopsie de peau sur son animal afin de le reproduire s’il s’avère performant et qu’il disparaît subitement.

Utilisation du cheval cloné dans le sport

Il serait tentant d’acheter le clone d’un crack et de le faire concourir. Certaines disciplines prévoyantes ont d’ores et déjà ajouté un article dans leur réglementation interdisant l’accès aux chevaux clonés, mais d’autres sont en retard, laissant une opportunité à ces animaux.

Courses

L’accès aux courses de trot et de galop, en France, est strictement interdit aux chevaux issus du clonage (encadré 2). En revanche, deux des trois mules clonées ont couru des courses aux États-Unis et elles semblent être très compétitives (deux victoires pour Idaho Gem et une victoire pour Idaho Star).

Sports équestres

Les compétitions internationales de sports équestres sont régies par le règlement de la Fédération équestre internationale (FEI). Son dernier règlement (23^e édition), valable depuis le 1^er juin 2009, ne mentionne pas directement les chevaux clonés. Aucune interdiction ni aucune autorisation officielle à la participation de tels chevaux dans des compétitions de haut niveau n’est établie. De plus, les chevaux participant aux compétitions FEI ne doivent pas obligatoirement être inscrits dans un stud-book, mais simplement posséder un passeport d’une fédération nationale. Il est donc envisageable de voir un cheval cloné participer à une compétition internationale.

En revanche, pour les compétitions nationales de sports équestres en France, ce sont les règlements de la Fédération française d’équitation (FFE) qui sont à prendre en compte et ils stipulent que les chevaux doivent être inscrits dans un stud-book. Il convient donc de trouver un stud-book qui accepte d’enregistrer les clones. Depuis peu, un stud-book européen, le stud-book Zangersheide ou stud-book Z, accepte l’inscription des clones de chevaux de sport de qualité dans son registre. Il est également probable que des clones participent à des compétitions, même si ce n’est pas autorisé : ils apparaîtraient alors sans origine connue.

Le stud-book français du cheval anglo-arabe et le stud-book du selle français ne contiennent pas encore d’article interdisant l’inscription de chevaux clonés. En revanche, les animaux clonés sont déjà interdits dans les stud-books français suivants : poney highland, poney français de selle, poney haflinger, poney new forest, poney welsh, cheval fjord, cheval auxois, cheval percheron et cheval boulonnais.

Enregistrement des produits de clones

Les animaux clonés peuvent être utilisés comme reproducteurs sans qu’une autorisation particulière soit demandée. Cependant, pour les étalons, cela signifie qu’ils ne seront pas inscrits sur la liste de ceux qui sont affiliés par les Haras nationaux pour la reproduction, mais qu’ils reproduiront en “monte libre”. La déclaration et l’identification des produits devront donc passer par un système particulier : la naissance avec appellation Origines constatées (OC). Une réflexion sur le sujet du clonage est menée dans chaque stud-book et les positions évoluent. Depuis peu, Pieraz-Cryozootech-Stallion a reçu son approbation pour faire la monte dans le jeune stud-book AES et E.T.-Cryozootech-Stallion dans le stud-book Zangersheide. D’autres stud-books pourraient suivre rapidement. Ils sont donc règlementairement prêts à faire la monte publique.

La technique de clonage somatique chez le cheval n’en est qu’à ses débuts et quelques équipes de chercheurs s’attachent à en améliorer l’efficacité. Il s’agit d’un véritable défi pour les biologistes car toutes les étapes sont délicates dans cette espèce. Il est nécessaire d’améliorer l’efficacité de chacune d’entre elles pour faire progresser le résultat global, qui est encore extrêmement faible actuellement [³⁰]. De nombreuses applications scientifiques et médicales sont offertes par cette nouvelle biotechnologie. Cependant, le cheval n’est pas une espèce d’expérimentation utilisée couramment et l’emploi du clonage somatique dans cette espèce est surtout axé sur l’optique de reproduire à l’identique un animal de haute valeur génétique. Une question reste en suspens : quel est l’avenir des clones et de leurs produits ? Quelle utilisation le milieu équin leur accordera-t-il dans les années à venir ?

• D’après [¹⁸, ¹⁹].

• D’après [¹⁰, ¹¹].

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