Prélèvements d'interprétation ou d'utilisation délicate en pathologie infectieuse

Compte tenu des observations précédentes et de l'importance de la flore physiologique de certains “compartiments” biologiques, comment pourront être interprétés les résultats dans les cas délicats et quelles sont les spécificités équines dans ce domaine ?

Liquide synovial

Les prélèvements de liquide synovial lors de suspicion d'arthrite septique sont usuellement classés en cinq catégories selon l'origine de celle-ci [55]. La cytologie peut être trompeuse dans la mesure où les modifications apparaissent parfois lentement. La microbiologie de ces liquides est particulière car les barrières tissulaires jouent le rôle de filtre et rendent les cultures bactériennes peu sensibles. Il convient de garder les prélèvements plus de six jours en culture, d'identifier tout germe mis en évidence et de réaliser un antibiogramme. Les milieux pour hémoculture sont recommandés pour pallier ces défauts de sensibilité. Ils permettent de mettre en route la culture pendant le transport si l'échantillon doit être envoyé, et ce dès que la ponction est réalisée. Chez le poulain, les germes retrouvés dans les liquides d'arthrite septique sont en général tous ceux qui sont potentiellement responsables de septicémie [36, 50]. Une attention particulière doit être accordée aux synovites non septiques chez le poulain ; elles sont déclenchées par des germes comme Rhodococcus equi qui peuvent aussi générer ce type d'inflammation associé à l'action d'immuns complexes sur les membranes synoviales [36].

Liquide de paracentèse abdominale

L'intérêt de l'examen bactériologique dans ce cas est non seulement d'isoler un ou plusieurs germes responsables, mais aussi, le cas échéant, d'effectuer un antibiogramme sur ces derniers.

Ainsi, 38 % des liquides de paracentèse abdominale confiés à notre laboratoire entre 1999 et 2003 se sont avérés contenir des agents infectieux (chiffres non publiés obtenus sur 389 liquides).

Les plus fréquents sont les bactéries dites anaérobies, ainsi que la flore bactérienne intestinale constituée principalement d'entérobactéries.

Les salmonelles doivent être systématiquement recherchées. Citons également Clostridium perfringens (types A et C), Bacteroides fragilis et spp. (résistants à 80 % à la pénicilline) et Escherichia coli.

Dans 20 % des cas, une bactérie anaérobie est isolée et, le plus fréquemment, il s'agit de Bacteroides fragilis. Parmi les bactéries aérobies, Escherichia coli semble être la plus fréquente [18, 69].

L'interprétation de ces cultures bactériennes doit parfois être nuancée, surtout si la population microbienne est diversifiée. Le comptage des bactéries dans le liquide donne une bonne indication sur la possibilité ou non d'une contamination. Les liquides abdominaux infectieux contiennent en général plus de 10 000 bactéries par millilitre.

C'est ici que le tube sec stérile a toute son utilité, ainsi que l'envoi sous couvert (même relatif) du froid.

Rappelons qu'une bactérie comme Clostridium perfringens se dédouble toutes les vingt minutes dans les conditions idéales (25 à 28 °C) !

Les liquides de paracentèse abdominale présentant une population bactérienne abondante et dite “pathogène” doivent faire l'objet d'un antibiogramme afin de conforter un choix thérapeutique.

Certains prélèvements abdominaux chez des chevaux sous antibiothérapie sont stériles lorsqu'ils arrivent au laboratoire. Dans ce cas, l'examen cytologique est d'un recours indispensable pour mettre en évidence l'inflammation et la perméabilité des séreuses. Cet examen revêt alors un intérêt pronostique.

Lors de septicémie chez le foal, le liquide péritonéal est très souvent réactionnel, et il n'est pas rare d'en isoler les bactéries qui ont passé la barrière vasculaire ou entérique.

Dans le cas de clostridiose intestinale, le nombre de bactéries présentes dans le prélèvement n'est pas toujours en rapport avec la gravité des symptômes observés (les effets constatés sont parfois ceux de la toxine bactérienne seule).

La présence d'hématies en grand nombre dans la cavité abdominale doit attirer l'attention sur les possibilités de migration larvaire (Strongylus) et de rupture d'artérioles mésentériques.

L'absence de bactéries ne suffit pas à exclure une cause infectieuse. Il convient d'avoir recours aux examens cytologique et biochimique du liquide pour confirmer cette hypothèse (glucose, fibrinogène, etc.).

Écouvillon nasopharyngé

La flore bactérienne normale des voies respiratoires supérieures est tellement diverse (Rhodococcus equi peut être isolé chez des poulains sains et Streptococcus equi subs. zooepidemicus chez l'adulte) que l'écouvillon nasopharyngé (voir l'encadré “Écouvillon nasopharyngé”) n'est bien souvent d'aucune utilité chez le poulain ou l'adulte pour orienter ou confirmer un diagnostic. Le praticien peut néanmoins y avoir recours en cas de suspicion clinique de gourme (pus évocateur, symptômes associés, contagiosité, etc.). Il convient de préciser cette orientation au laboratoire qui doit mettre en œuvre des modes opératoires adaptés de façon à ne pas perdre de sensibilité. L'agent responsable de la gourme, sensible aux phénomènes de “dominance”, est parfois masqué par des streptocoques autres que Streptococcus equi. Une méthode par amplification génique est aussi disponible [1]. Elle peut apporter une amélioration en termes de sensibilité, même si son intérêt principal reste la détection des porteurs sains dans les nœuds lymphatiques ou les lavages de poches gutturales [59].

Il convient de réserver majoritairement l'utilisation de l'écouvillon nasopharyngé aux suspicions de maladies virales ou de gourme lorsque le poulain ou l'adulte présentent une hyperthermie ou des sécrétions nasales séreuses.

L'ensemble des virus respiratoires peut être recherché par culture ou amplification génique (PCR). Il convient de ne pas négliger tous les herpèsvirus potentiellement impliqués lors de la demande d'analyse en fonction du contexte épidémiologique de l'élevage. L'herpèsvirus équin de type 2 est notamment évoqué pour intervenir dans les mécanismes de déclenchement de pneumonie bactérienne ou des maladies inflammatoires des voies respiratoires moyennes [10, 35]. Il est nécessaire d'y penser aussi, comme aux autres herpèsvirus, lors de conjonctivite, de kératite et d'uvéite.

Toute réponse “positive” sera univoque dans la mesure où le portage latent ou chronique de ces virus n'est ni décrit, ni envisagé (différence avec les bactéries) dans les compartiments respiratoires supérieurs.

Lors de pharyngite folliculaire, il peut aussi être intéressant d'écouvillonner si le praticien souhaite connaître l'agent en cause (dans le cas de contagiosité, par exemple, ou de récidive après traitement, etc.). La pharyngite folliculaire est présente chez la très grande majorité des poulains et jeunes chevaux, notamment de course, mais les herpèsvirus de type 4 sont parfois retrouvés sur ces prélèvements (données non publiées du Laboratoire départemental Frank-Duncombe [LDFD]).

Les bactéries et les champignons de la flore usuelle des voies respiratoires supérieures peuvent y être retrouvés en quantité abondante et en culture pure, mais les causes virales (EHV4 notamment) ne doivent pas être oubliées et un prélèvement adéquat est requis (milieux de transport virus pour culture ou PCR).

L'exploration des poches gutturales (lavage), acte un peu plus invasif, peut s'avérer intéressant pour les analyses bactériologique et mycologique (aspergillose, pseudomonose, etc.). La recherche de Streptococcus equi (gourme) à partir de ce prélèvement est aussi possible pour dépister les porteurs sains ou certaines formes cliniques. Dans ce cas, la méthode PCR est recommandée.

Liquides respiratoires

L'interprétation des analyses microbiologiques des liquides respiratoires est parfois difficile en raison d'une flore commensale présente naturellement jusqu'aux grosses bronches (et de la contamination trachéale par la flore saprophyte pharyngée lors du passage de l'endoscope) et de l'action parfois controversée de bactéries saprophytes qui peuvent jouer un rôle dans la genèse ou l'entretien de phénomènes infectieux et/ou inflammatoires [41, 48].

Une attention toute particulière est nécessaire afin de ne pas contaminer le prélèvement récolté. Les aspirations trachéales (AT) sont les plus faciles à réaliser de façon stérile [5]. L'écouvillon de sécrétions trachéales fait à l'aide d'un endoscope et d'une brosse stérile enveloppée dans une double gaine est aussi une possibilité, moins traumatique que l'AT. La présence d'une flore microbienne très diversifiée (plus de deux germes dominants) et de cellules malphigiennes (pharynx) permet d'émettre une interprétation sous réserve, car elle est souvent le signe d'une contamination accidentelle de l'échantillon recueilli [22, 60].

Les lavages broncho-alvéolaires sont réservés à l'exploration des maladies inflammatoires diffuses de l'appareil respiratoire [16].

Bactériologie des liquides respiratoires

Les prélèvements trachéaux sont d'interprétation délicate en raison de la diversité des résultats obtenus sur diverses populations témoins (chevaux sains, sans affection clinique évidente, performants, etc.), et du fait que de nombreuses bactéries peuvent faire partie de la flore transitoire ou permanente de l'appareil respiratoire moyen. Il convient donc de tenir compte de :

- la quantité de bactéries présentes (numération bactérienne) [32, 60] ;

- la pathogénicité des bactéries identifiées ;

- la confirmation par la cytologie de l'hypothèse infectieuse (image de phagocytose, activation des macrophages ou des polynucléaires, présence de bactéries visibles sur les lames colorées, etc.) et la vérification que des cellules squameuses épithéliales du pharynx (souvent de type malphigien) n'ont pas été transportées dans le liquide en contaminant le prélèvement ;

- l'acheminement du liquide dans des conditions correctes, avec un tube sec (qui sert aussi aux analyses de virologie).

Certains travaux ont démontré une corrélation significative entre la toux et la population bactérienne des liquides de lavage malgré d'assez grandes variations chez les chevaux dits “sains” performants [60]. La présence d'une à deux familles bactériennes réputées pathogènes chez le cheval, à des numérations supérieures à 103 UFC/ml (unités formant colonie par millilitre) [32] à 105 [60], est souvent significative par rapport à ce qui est décrit chez les animaux sains.

Dans les LBA, la population bactérienne commensale se raréfie (bactéries, pollen, débris végétaux, éléments fongiques). L'examen minutieux de ces “résidents” est important car il renseigne sur :

- le mode de vie des chevaux examinés (box, herbage, etc.) ;

- l'efficacité des fonctions du liquide épithélial broncho-alvéolaire (PELF) et du surfactant, de l'appareil mucociliaire et des cellules spécialisées (macrophages notamment).

Là encore, le compte rendu de l'examen cytologique est indispensable.

La recherche de mycoplasmes fait partie intégrante de tout protocole systématique.

Ces agents pathogènes occasionnels interviennent parfois dans l'entretien ou le déclenchement d'une infection ou d'une inflammation de l'appareil respiratoire profond [71].

Les ^{“Répartition des espèces bactériennes à Gram négatif isolées dans les prélèvements d'origine respiratoire”} et ^{“Répartition des espèces bactériennes à Gram positif isolées au LDFD dans les prélèvements d'origine respiratoire”} reprennent l'ensemble des données compilées [8] sur la fréquence d'isolement des germes dans les voies respiratoires du cheval et le ^{“Pourcentage de sensibilité d'espèces bactériennes d'origine équine isolées au LDFD en 2004 vis-à-vis de différents antibiotiques”} présente les spectres les plus fréquents d'antibiosensibilité dans cette espèce.

Virologie

Le mode d'obtention de ces liquides dilue artificiellement le prélèvement. Le moment d'intervention ou d'appel du vétérinaire dans les conditions du terrain ne correspondant pas toujours à la phase précoce de la maladie, il est parfois difficile de mettre ces virus en évidence dans les prélèvements confiés.

Une fois encore, la cytologie oriente le choix des examens complémentaires, avec une règle à retenir pour les maladies virales : « Pas de maladies virales respiratoires sans modifications cellulaires des épithéliums concernés. »

Les cellules épithéliales (premières cibles de réplication pour les virus) constituent une part importante de l'examen cytologique des liquides d'exploration tels que les AT ou les LBA [68]. Toute anomalie morphologique de ces cellules cibles pour les virus (ciliocytophtorie, par exemple) doit être signalée par le laboratoire.

Il est possible depuis plusieurs années d'avoir recours aux méthodes dites d'amplification génique, qui ont pour principal défaut de pouvoir amplifier aussi des génomes viraux latents dans les cellules lymphocytaires associées aux bronches (BALT) ou dans les lymphocytes alvéolaires [2, 17, 45]. Pourtant, de nombreux travaux à partir d'enquêtes de clientèle [15] ou incluant un grand nombre de cas référés pour maladie respiratoire [22] montrent que la plupart des suspicions cliniques ou des commémoratifs associés aux cas qui motivent ces examens respiratoires approfondis suggèrent un “passage viral récent”.

Certains essais ont aussi évoqué la participation des maladies virales dans la genèse des affections respiratoires équines [22, 68], et cela à deux niveaux :

- par le déclenchement d'une maladie inflammatoire des petites voies respiratoires chez les jeunes chevaux à l'entraînement lors de réactivation herpétique ou de primo-infection virale ;

- par une participation comme cofacteur de chronicité ou de contre-performance.

D'autres équipes semblent plutôt placer les bactéries avant les virus dans la genèse de ces troubles respiratoires [16].

Écouvillons génitaux

Ces prélèvements s'adressent principalement aux protocoles de monte suivant les races et leurs codes de pratique, mais aussi au dépistage de la métrite contagieuse équine (MCE), une maladie à déclaration obligatoire (MDO).

L'interprétation est parfois aisée lorsque, comme chez les pur-sang, les trois bactéries : Taylorella equigenitalis, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa, doivent être recherchées selon les recommandations du Code de pratique sanitaire de cette race.

La MCE n'est pas une maladie clinique sévère, mais elle doit sa gravité et sa classification en maladie à déclaration obligatoire à sa contagiosité et à ses conséquences économiques potentielles pour l'élevage et les échanges commerciaux.

Après quelques années de faible incidence, 2004 a vu la recrudescence de la MCE, ce qui incite à ne pas négliger ce diagnostic en cas de signes cliniques, mêmes discrets.

Les résultats de ces écouvillons génitaux en dehors de ces protocoles doivent être pris avec précaution et seul le clinicien peut les interpréter à l'aide de l'examen génital préalable. En l'absence de signes cliniques locaux, les cultures mettant en évidence de nombreux germes, sans flore dominante, n'ont que peu d'intérêt. Depuis plusieurs années, la présence de certains germes comme Pantoeasp., Acinetobacter spp. ou E. coli est notée. Ces bactéries présentent parfois des spectres de résistance assez marqués et sont retrouvées lors de septicémie néonatale. Les résultats bactériologiques des écouvillons pratiqués chez les mères peuvent parfois servir au praticien en cas de septicémie chez le foal lors du choix thérapeutique des premières heures avant les résultats de laboratoire (hémoculture…).

Fèces et coproculture

C'est un examen de laboratoire parfois complexe à interpréter tant la flore bactérienne normale des équidés est riche et diversifiée.

Les conditions d'acheminement pour ces échantillons sont déterminantes.

Le laboratoire doit, à l'aide d'un examen direct (qui peut être fait en clinique avec des kits de coloration de première intention), déterminer la flore dominante. Ce premier test permet dans certains cas d'orienter les recherches ultérieures en culture.

Les commémoratifs cliniques ou épidémiologiques sont souvent déterminants pour aboutir à un diagnostic de laboratoire.

Chez l'adulte

Les clostridioses demeurent des causes fréquentes de diarrhée ou de pathologie abdominale. Les coprocultures doivent rechercher les clostridies entéropathogènes (Clostridium perfringens, Cl. sordellii, Cl. septicum, etc.), y compris Clostridium difficile [4]. C'est la mise en évidence de la toxine de Cl. difficile qui permet de poser un diagnostic de certitude (et non la culture bactérienne seule).

La recherche de salmonelles dans les crottins par culture fait aussi partie des protocoles classiques de laboratoires spécialisés. Il n'est pas rare d'obtenir des examens négatifs chez des chevaux pourtant atteints de salmonellose du fait de l'excrétion intermittente et de la concentration bactérienne plus faible dans les fèces diarrhéiques. Il est donc recommandé d'effectuer plusieurs prélèvements chez différents individus. Par ailleurs, les cas de salmonellose touchant un seul animal au sein d'un effectif ne sont pas rares.

Ces maladies doivent aussi être évoquées chez les adultes immunodéprimés ou en condition de moindre résistance, notamment dans les phases postchirurgicales.

De nombreux résultats de coproculture sont délicats à interpréter chez l'adulte car ils ne montrent parfois qu'une flore dominante habituellement peu pathogène dans le tube digestif. À ce titre, la détection des entérotoxines bactériennes devient déterminante. Les colibacilles, par exemple, étaient autrefois écartés des hypothèses diagnostiques lorsqu'ils ne présentaient pas d'hémolysine sur les milieux de culture au sang. Aujourd'hui, chez les chevaux comme chez les bovins, ces bactéries sont connues pour pouvoir présenter des toxines ou des facteurs de pathogénicité (entéro-adhésine, facteurs d'attachement, etc.).

Plusieurs méthodes de recherche de la toxine de Clostridium difficile ont été décrites et certaines sont réalisées en routine dans les laboratoires spécialisés [38].

Chez le poulain

Les cultures bactériennes sont surtout intéressantes sur les fèces de poulains diarrhéiques. L'hémoculture doit être envisagée en complément lors de foyer septique suspecté. Il s'agit alors de rechercher des colibacilles entéropathogènes (toxines, facteurs d'attachement, hémagglutinines, etc.). Certains de ces colibacilles à haut potentiel de virulence (facteurs d'attachement, d'invasion tissulaire, etc.) ne sont pas toujours des germes hémolytiques retenant habituellement l'attention des laboratoires non spécialisés en biologie vétérinaire. La recherche de ces facteurs de virulence est importante à rapprocher de la clinique et du contexte épidémiologique de foyers éventuels car ces germes peuvent aussi être hébergés chez des poulains sains [32 bis].

L'isolement de Rhodococcus equi dans les fèces de poulain n'est pas toujours significatif car il fait partie de la flore intestinale normale de l'animal, cette bactérie étant tellurique [61]. Ces bactéries génétiquement munies d'un plasmide de virulence peuvent provoquer des abcès mésentériques, des ostéomyélites ou des abcès musculaires chez le poulain, plus rarement chez l'adulte. Une sérologie et des examens complémentaires (numération et formule sanguines et dosage du fibrinogène) permettent d'établir un diagnostic plus précis.

En ce qui concerne Salmonella, de nombreux chevaux sont des porteurs sains de façon plus ou moins continue (surtout avec Salmonella dublin qui peut demeurer dans les structures lymphoïdes locales). Les cas de salmonellose chez le poulain sont en général graves (du fait de la dissémination du sepsis et du risque élevé de septicémie), et ils nécessitent un sérotypage de la souche en cause et un antibiogramme. En cas de clostridiose chez le poulain, 1 000 bactéries par gramme de crottin prélevé et acheminé dans de bonnes conditions sont significatives (la mise en évidence de l'entérotoxine est par ailleurs indispensable). D'autres bactéries comme Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Aeromonas hydrophila peuvent aussi retenir l'attention [39 bis]. Les selles se négativant rapidement et du fait d'une possible excrétion discontinue, l'échantillon doit être prélevé directement dans le rectum, et il convient de prévenir le laboratoire, de raccourcir le délai de mise en culture (moins de 24 heures) et d'utiliser des milieux de transport spécifiques. Lawsonia intracellularis doit aussi être recherchée lors de diarrhée mucoïde, avec une hypoprotéinémie ne rétrocédant pas aux traitements habituels. Cette bactérie intracellulaire de la muqueuse iléo-jéjunale a été décrite initialement chez le porc, puis dans des foyers de gastro-entérite chez le poulain [37]. Le diagnostic, délicat, se fait par PCR sur les fèces ou un examen histologique.

C'est une maladie du poulain au sevrage à laquelle il convient de penser lorsque les analyses de première intention n'ont pas apporté de résultats satisfaisants.

Les Rotavirus du groupe A représentent une des causes les plus importantes de diarrhée infectieuse chez le poulain. Ils sont recherchés en priorité lors d'épisodes contagieux, de courte incubation. Les tests disponibles qui détectent les antigènes viraux sont fiables et donnent des réponses rapides [39 bis].

Prélèvements d'avortement

La fréquence des avortements dans l'espèce équine est estimée entre 8 et 19 % selon les auteurs et les races de chevaux. Le pourcentage d'avortements d'origine indéterminée peut varier de 16 à 40 %, selon les moyens d'investigation mis en œuvre et les travaux publiés. Les causes infectieuses identifiées représentent de 16 à 30 % [30 bis,58 bis]. Le coût des recherches et le manque d'outils de dépistage adaptés aux laboratoires de diagnostic ne permettent pas toujours de réaliser l'ensemble des recherches souhaitées en pratique courante.

Certains agents abortifs, bien connus chez l'homme et les bovins, n'ont été que très peu décrits dans l'espèce équine. En effet, les informations sont souvent issues d'un ou deux laboratoires, et aucune donnée précise n'existe à ce jour en France. Les données de la littérature font apparaître l'implication de bactéries comme les leptospires, Coxiella burnetii (agent responsable de la fièvre Q), Chlamydophila abortus [31] et Listeria monocytogenes, mais aussi de parasites comme ceux de la famille de Neospora [52].

Beaucoup de ces agents pathogènes ont pu être détectés et identifiés grâce au développement des nouvelles techniques de biologie moléculaire et, en particulier, par les méthodes d'amplification génique. En effet, les techniques classiques de culture bactérienne ne s'appliquent pas à la plupart de ces micro-organismes intracellulaires stricts (comme les virus). Elles restent dans certains cas très difficiles à mettre en œuvre, comme la culture des leptospires (voir l'article “Focus sur quelques maladies et les progrès récents en matière de diagnostic”, des mêmes auteurs, dans ce numéro). L'application systématique d'un protocole complet et le recours aux outils de biologie moléculaire ont aussi montré que, pour des agents abortifs bien connus dans cette espèce comme les herpèsvirus (EHV1 notamment), l'utilisation du placenta est déterminante en raison du comportement de certaines souches virales et de leur faible invasion des tissus fœtaux ou maternels [28, 58].

Selon des travaux récents, d'une part, le placenta doit toujours être associé aux examens de laboratoire et, d'autre part, ces derniers sont requis même en l'absence de lésions macroscopiques.

Par ailleurs, les herpèsvirus et le virus de l'artérite virale doivent être incorporés aux examens de routine, ainsi que la bactériologie générale dont les agents sont à eux seuls responsables de plus de 50 % des avortements ayant pour origine une infection [20]. À ce jour, les recherches systématiques de Leptospira, de Chlamydophila, de Coxiella et de Neospora caninum restent discutables en première intention. Ces agents doivent néanmoins être envisagés par le praticien lors d'avortements répétés (plus de deux) dans un laps de temps assez court.

Rappelons, enfin, que ces prélèvements rapidement dégradables (autolyse) requièrent un acheminement rapide vers les laboratoires spécialisés.