Pratique vétérinaire équine n° 178 du 01/04/2013
 

Article de synthèse

Albertine Léon*, Andrew Waller**


*Laboratoire Frank Duncombe,
Fondation Hippolia,
université de Caen,
1, route de Rosel, 14053 Caen Cedex
**Centre for Preventive Medecine,
Animal Health Trust,
Lanwades Park, Kentford,
Newmarket CB8 7UU, United Kingdom

Les analyses de laboratoires sont une aide incontournable dans le diagnostic de la gourme, pour évaluer l’étendue d’une épidémie ou détecter les porteurs asymptomatiques.

Résumé

La gourme est la première maladie infectieuse du cheval à travers le monde. La détection rapide et précise des chevaux infectés par Streptococcus equi subspecies equi (S. equi), bactérie responsable de cette infection, est fondamentale pour réduire l’impact économique de cette maladie.

L’objet de cet article est de présenter les méthodes de diagnostic utilisées en laboratoire afin d’identifier les chevaux infectés par S. equi. Elles vont être divisées en méthodes directes regroupant le diagnostic bactériologique et la réaction de polymérisation en chaîne, et en méthode sérologique indirecte. Quelques stratégies de gestion des animaux pour contrôler la propagation et, ainsi, éradiquer la gourme sont aussi proposées.

Summary

Laboratory diagnosis of strangles

Strangles is the most common worldwide infectious disease affecting horses.

The rapid and accurate detection of horses infected with Streptococcus equi subspecies equi (S. equi), the bacteria responsible for this infection, is fundamental to reducing the economic impact of this disease. The purpose of this paper is to present diagnostic methods used in the laboratory to identify horses infected with S. equi. The methods are divided into direct methods including bacteriological diagnosis and polymerase chain reaction tests, and an indirect serological method. This paper also presents some strategies for managing animals in order to control the spread and thus eradicate strangles.

Key words

Horse, strangles, Streptococcus equi, Elisa, PCR

La gourme est une maladie très contagieuse touchant les équidés et caractérisée par une forte inflammation des muqueuses nasales et pharyngées, accompagnée d’une hypertrophie des ganglions lymphatiques, notamment rétropharyngés. Elle est provoquée par une bactérie, Streptococcus equi subspecies equi (S. equi), à ne pas confondre avec Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (S. zooepidemicus), bactérie commensale des cavités nasales [11, 12, 15].

La difficulté de l’épidémiologie de la gourme réside dans le fait qu’environ 10 % des chevaux malades deviennent des porteurs chroniques après la guérison. La détection de ces porteurs sains ou subcliniques est un élément essentiel dans la prévention de cette affection.

L’apparition de la gourme dans un élevage entraîne des pertes économiques non négligeables, avec un coût de traitement d’autant plus élevé que le nombre de chevaux atteints est grand, tout en rendant ces derniers indisponibles pendant plusieurs semaines.

De plus, le risque d’apparition et de propagation d’épizooties de gourme croît en raison, notamment, d’une densification du nombre de chevaux et de l’internationalisation des compétitions, des courses et du commerce des équidés.

Pour gérer efficacement une épidémie de gourme, un diagnostic définitif doit être établi rapidement.

Cet article a pour objectif de présenter les outils de diagnostic de la gourme qui sont à la disposition du vétérinaire ainsi que quelques stratégies de gestion des chevaux pour contrôler la propagation de la maladie (encadré).

Les analyses biochimiques de première intention

Les analyses biochimiques de première intention sont effectuées à partir de prélèvements sanguins dès l’apparition d’une suspicion de gourme (photo 1).

Les numération et formule sanguines sont réalisées sur tube EDTA. Les données paracliniques sont caractéristiques d’un tableau inflammatoire. Ainsi les taux de neutrophiles sont généralement supérieurs à 25 000/µl et une anémie peut être observée.

Une recherche de certains marqueurs de l’inflammation peut également être réalisée. Ainsi, la concentration sérique de fibrinogène (recherche sur tube citrate 9 %) est augmentée avec des valeurs supérieures à 5 mg/ml, de même que les concentrations de sérum amyloïde A dont la recherche est exécutée sur tube sec.

Les méthodes directes

Les prélèvements de choix pour une recherche directe de S. equi sont les écouvillons nasaux ou naso-pharyngés, les lavages des cavités nasales ou des poches gutturales, et surtout le prélèvement des nœuds lymphatiques abcédés. Ce dernier prélèvement se déroule préférentiellement par grattage de la coque des abcès car le pus peut parfois se révéler stérile.

Diagnostic bactériologique

Le diagnostic bactériologique est établi par ensemencement des prélèvements sur des milieux de culture appropriés afin d’isoler puis d’identifier la bactérie en cause.

S. equi est un coque Gram positif, de 0,6 à 1 µm de diamètre, souvent assemblé en chaîne de longueur variable (photo 2a). C’est une bactérie β-hémolytique capable de produire une hémolysine, substance pouvant détruire les hématies. Elle appartient aux streptocoques du groupe C de la classification de Lancefield [4].

S. equi pousse en aérobiose et à 37 °C sur gélose au sang (milieu solide) mais également sur un bouillon cœur-cervelle (milieu liquide) enrichis en nutriments [2].

Sur gélose au sang, les colonies s’entourent d’un halo de 2 à 4 mm de diamètre caractéristique de la β-hémolyse après 24 heures d’incubation (photo 2b). En bouillon, la croissance des bactéries lui confère un aspect trouble, avec formation d’un sédiment visqueux.

La différenciation de S. equi avec les autres streptocoques est effectuée par la recherche de ses capacités hémolytiques et des antigènes typiques du groupe C par un test d’agglutination sur latex. Cette identification est confirmée par des tests biochimiques à l’aide de galeries d’identification type galeries API (Biomérieux, 69280 Marcy-L’Étoile). Une première orientation est obtenue après 24 heures de culture. Le diagnostic définitif est établi au bout de 2 à 3 jours. L’interprétation de résultats négatifs en bactériologie, notamment sur les prélèvements provenant de chevaux avec des signes cliniques typiques, doit être réalisée avec prudence. En effet, les abcès qui se drainent naturellement sont rapidement colonisés par d’autres bactéries (S. zooepidemicus et Streptococcus equisimilis, notamment) et ces populations de bactéries contaminantes peuvent masquer ou gêner le développement de S. equi sur les milieux de culture, donnant ainsi un résultat faussement négatif pour la gourme.

Diagnostic par amplification génique (PCR)

Le diagnostic par PCR (polymerase chain reaction), reposant sur l’amplification in vitro de séquences d’ADN spécifiques du génome de S. equi, permet de confirmer un cas de gourme en quelques heures après la réception du prélèvement. Les premiers tests PCR développés avaient pour cible la région 5’ du gène codant pour la protéine SeM, le principal facteur de virulence de S. equi [8, 13]. Ce gène, d’abord considéré comme hautement conservé, s’est révélé variable dans le temps et des délétions ont même été observées sur des souches isolées de chevaux infectés permanents [5, 12].

D’autres tests PCR ont alors été développés ciblant les gènes codant pour les superantigènes (facteurs responsables d’effets délétères pour l’hôte : toxines, etc.) tels que nommés SeeH, SeeI, SeeL et SeeM [3]. Mais, des souches de S. zooepidemicus se sont révélées positives pour les PCR amplifiant les gènes seeL et seeM [7]. Cela a pu conduire à rendre des résultats faussement positifs.

Alber et coll. ont travaillé au développement d’une PCR multiplex pour l’identification et la différenciation de S. equi et S. zooepidemicus reposant sur la détection simultanée des gènes seel et sodA codant pour la superoxyde dismutase A [1].

De plus, les prélèvements à analyser peuvent parfois contenir des inhibiteurs de PCR, rendant le résultat ininterprétable. L’ajout d’un contrôle interne d’extraction et/ou d’amplification devient alors indispensable.

La technique PCR a beaucoup évolué ces dernières années. L’invention de la PCR en temps réel permet l’amplification quantitative des gènes cibles avec une visualisation en temps réel du résultat qui évite une étape supplémentaire d’électrophorèse sur gel d’agarose (figure 2).

En s’appuyant sur cette nouvelle technologie, Webb et coll. ont développé en 2013 une PCR quantitative (qPCR) qui permet une identification plus précise et sensible des chevaux infectés avec S. equi et ainsi réduire le nombre de résultats faussement négatifs [18]. Cette PCR repose sur la détection simultanée de deux gènes spécifiques et conservés chez S. equi : eqbE, codant une protéine impliquée dans l’assimilation du fer par S. equi, et SEQ2190, codant un ligand d’une famille enzyme nommée sortase, avec la probabilité très faible que ces deux gènes soient absents d’une même souche de S. equi [7, 9]. Les limites de détection sont respectivement de 20 copies pour eqbE et de 10 copies pour SEQ2190. Les prélèvements à analyser pouvant parfois contenir des inhibiteurs de PCR, ce test contient également une troisième cible permettant de contrôler le bon déroulement des étapes d’extraction et d’amplification de l’ADN.

Ce test plus sensible va permettre aussi de réduire considérablement le nombre de faux négatif.

La technique PCR est plus rapide et plus sensible que la culture. Même si elle ne permet pas de différencier les bactéries vivantes des bactéries mortes, un résultat positif en PCR doit être traité comme un cas avéré de gourme. L’utilisation conjointe de la bactériologie et de la PCR reste le protocole le plus fiable.

Méthode indirecte : examen sérologique

L’examen sérologique est effectué à partir d’un prélèvement de sang réalisé sur tube sec. La détection des anticorps anti-S. equi dans le sérum des chevaux peut aider à identifier un cheval apparemment en bonne santé mais qui est un porteur infecté permanent, et ainsi prévenir un nouvel épisode de gourme. En effet, la persistance de S. equi dans leurs poches gutturales est associée à une hyperplasie folliculaire qui permet une mesure de la réponse en anticorps [17]. Le test iElisa (indirect enzyme-linked immunosorbent assay) actuellement utilisé en France mesure le taux d’anticorps sériques anti-protéine SeMb (antigène C), avec la protéine SeM comme un facteur de virulence majeur de S. equi (IDvet, photo 3) [14]. Ce test permet de détecter uniquement les chevaux à risque pour la vaccination et à risque de présenter un abcès métastatique ou un purpura (confirmation d’un diagnostic clinique).

L’équipe de Robinson et coll., en 2013, a utilisé les données de séquençage du génome de S. equi pour mettre au point un second test iElisa indirect qui cible deux fragments protéiques spécifiques de S. equi : SEQ2190 (antigen A) et SeM (antigen C) [10].

Les performances de ces deux tests ont été comparées sur une même population de chevaux [10]. La sensibilité du test iElisa ciblant uniquement l’antigène C serait de 89,9 % et sa spécificité serait proche de 77 %. En revanche, le test iElisa combinant les résultats obtenus avec les antigènes A et C affiche une sensibilité de 93,3 % et une spécificité de 99,3 % fournissant un test plus robuste pour l’identification de chevaux exposés à S. equi.

Les titres sériques dessinent un pic 4 à 5 semaines après l’exposition naturelle et restent élevés pendant 6 à 8 mois. En conséquence, un résultat positif indique une réponse sérologique à une exposition à S. equi mais ne permet pas de savoir si l’infection est en cours ni de mettre en évidence le statut de porteur. Ces informations sont fournies par la culture bactérienne et la PCR. En outre, la sérologie ne distingue pas les réponses vaccinales et infectieuses. Elle doit plutôt être considérée comme un outil de diagnostic de groupe ou de formes atypiques (subclinique) de gourme. L’examen sérologique n’est pas utile au diagnostic des formes classiques.

Conclusion

Le diagnostic rapide et de bonnes mesures de biosécurité sont les stratégies les plus efficaces pour prévenir la propagation de la gourme. Les outils de diagnostic présentés dans cet article autorisent la mise en place des traitements adaptés et/ou des stratégies de gestion pour limiter la propagation de la gourme au sein de l’élevage.

Des progrès en matière de génétique et de connaissance du génome par séquençage offrent la possibilité de développer une nouvelle génération de tests. Ainsi, les tests PCR et iElisa proposés respectivement par Webb et coll. et Robinson et coll. en 2013, utilisés au Royaume-Uni, vont être prochainement évalués en France avant d’être proposés en routine. Ils offrent de nouvelles perspectives dans le suivi épidémiologique des infections à S. equi, ce qui laisse présager une meilleure maîtrise de la gourme au sein des élevages équins.

Références

  • 1 – Alber J, El-Sayed A, Lämmler C et coll. Multiplex polymerase chain reaction for identification and differentiation of Streptococcus equi subsp. zooepidemicus and Streptococcus equi subsp. equi. J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 2004;51(10):455-458.
  • 2 – Bannister MF, Benson CE, Sweeney CR. Rapid species identification of group C streptococci isolated from horses. J. Clin. Microbiol. 1985;21(4):524-526.
  • 3 – Baverud V, Johansson SK, Aspan A. Real-time PCR for detection and differentiation of Streptococcus equi subsp. equi and Streptococcus equi subsp. zooepidemicus. Vet. Microbiol. 2007;124(3-4):219-229.
  • 4 – Chanter N, Collin N, Holmes N et coll. Characterization of the Lancefield group C streptococcus 16S-23S RNA gene intergenic spacer and its potential for identification and sub-specific typing. Epidemiol. Infect. 1997;118(2):125-135.
  • 5 – Chanter N, Talbot NC, Newton JR et coll. Streptococcus equi with truncated M-proteins isolated from outwardly healthy horses. Microbiol. 2000;146(Pt 6):1361-1369.
  • 6 – Heather Z, Holden MT, Steward KF et coll. A novel streptococcal integrative conjugative element involved in iron acquisition. Mol. Microbiol. 2008;70(5):1274-1292.
  • 7 – Holden MT, Heather Z, Paillot R et coll. Genomic evidence for the evolution of Streptococcus equi : host restriction, increased virulence, and genetic exchange with human pathogens. PLoS Pathog. 2009;5(3).
  • 8 – Newton JR, Verheyen K, Talbot NC et coll. Control of strangles outbreaks by isolation of guttural pouch carriers identified using PCR and culture of Streptococcus equi. Equine Vet. J. 2000;32(6):515-526.
  • 9 – Newton R. The application of the AHT S. Equi diagnostic ELISA. In: proceedings of ’Getting to grips with Strangles’ workshop. Stockholm, Suède, 27 et 28 mai 2010.
  • 10 – Robinson C, Steward KF, Potts N et coll. Combining two serological assays optimises sensitivity and specificity for the identification of Streptococcus equi subsp. equi exposure. Vet. J. 2013.
  • 11 – Sweeney C, Timoney J, Newton J, Hines M. Streptococcus equi infections in horses: guidelines for treatment, control, and prevention of strangles. J. Vet. Intern. Med. 2005;19:123-134.
  • 12 – Timoney JF. Strangles. Vet. Clin. North Am. Equine Pract. 1993;9:365-374.
  • 13 – Timoney JF, Artiushin SC. Detection of Streptococcus equi in equine nasal swabs and washes by DNA amplification. Vet. Rec. 1997;141(17):446-447.
  • 14 – Timoney JF, Artiushin SC, Boschwitz JS. Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-like protein SeM and SzPse. Infect. Immun. 1997;65:3600-3605.
  • 15 – Timoney JF. The pathogenic equine streptococci. Vet. Res. 2004;35(4):397-409.
  • 16 – Waller A. Strangles diagnosis (Which samples? Which analysis? In: proceedings of AVEF congress, Reims, France. 2012:295-298.
  • 17 – Waller AS, Jolley KA. Getting a grip on strangles: Recent progress towards improved diagnostics and vaccines. Vet J. 2007;173(3):492-501.
  • 18 – Webb K, Barker C, Harrison T et coll. Detection of equi subspecies equi using a triplex qPCR assay. Vet. J. 2013;195(3):300-304.

Éléments à retenir

→ Les prélèvements de choix pour une recherche directe de S. equi sont les écouvillons nasaux ou naso-pharyngés, les lavages des cavités nasales ou des poches gutturales, et surtout le prélèvement des nœuds lymphatiques abcédés.

→ L’évaluation de l’étendue d’une épidémie de gourme doit associer les différentes méthodes de diagnostic que sont la culture bactérienne, la réaction de polymérisation en chaîne et la sérologie.

→ Il est important d’identifier avec certitude et rapidement les porteurs asymptomatiques. Ce portage latent dans les poches gutturales des chevaux constitue le facteur de risque épidémiologique majeur de cette infection.

Conflits d’intérêts

Aucun.

Encadré : Application des outils de diagnostic comme stratégie pour prévenir et éradiquer la gourme

→ Étape 1 : Prévention de l’infection à S. equi

La difficulté majeure de la gourme est d’identifier les animaux porteurs infectés permanents, sans signes cliniques caractéristiques, qui peuvent disséminer la maladie. Il est préconisé pour un nouveau cheval qui entre dans un haras de lui faire subir une période de quarantaine de 3 à 4 semaines pendant laquelle son statut vis-à-vis de la gourme va être défini (figure 1).

Une analyse sérologique (test iElisa) permet de déterminer si le cheval a été récemment exposé à S. equi ou s’il s’agit d’un animal infecté permanent :

– si le résultat se révèle négatif, une nouvelle analyse est réalisée 2 semaines plus tard pour observer une séroconversion ou vérifier si le cheval testé était en phase d’incubation lors du premier prélèvement, car l’excrétion bactérienne peut être intermittente. Si le résultat de ce second test est également négatif, le cheval testé est déclaré indemne de gourme et peut rejoindre le reste de l’effectif ;

– si le résultat est positif, des analyses complémentaires sont nécessaires. Une endoscopie des poches gutturales permet de visualiser les signes d’une infection persistante (présence de chondroïdes) et l’analyse du lavage de ces poches par culture bactérienne et par réaction de polymérisation en chaîne quantitative devrait confirmer ce diagnostic. Cependant, si l’endoscopie n’est pas réalisable, une alternative est l’analyse d’un lavage ou d’un écouvillon naso-pharyngé par semaine, pendant 3 semaines consécutives. Si ces trois tests sont négatifs, le cheval testé est indemne de gourme et peut rejoindre le reste de l’effectif. Si l’une de ces analyses est positive, le cheval doit être traité (retrait des chondroïdes, gel de pénicilline dans les poches gutturales) et testé de nouveau 2 semaines après.

La zone de quarantaine doit être limitée et se situer à l’écart des autres zones du haras. Le matériel utilisé est dédié aux chevaux en quarantaine, qui sont examinés en dernier pour minimiser le risque de transmission de la maladie.

→ Étape 2 : Gestion d’une épidémie de gourme

Lorsqu’un cas de gourme est suspecté (syndrome fébrile avec un abattement, un jetage nasal purulent et une hypertrophie des ganglions lymphatiques), il est important de l’isoler et d’appliquer des mesures d’hygiène strictes. Les chevaux de l’effectif sont à répartir en trois groupes :

– groupe 1 : il regroupe les chevaux pré­sumés infectés (rouge) ;

– groupe 2 : il englobe tous les chevaux ayant été en contact direct ou indirect avec ceux du groupe 1. Ils courent un risque d’avoir été exposés à S. equi mais ne présentent pas de signes cliniques caractéristiques de la gourme (jaune) ;

– groupe 3 : il contient les chevaux sains qui n’ont pas été en contact direct ou indirect avec les animaux du groupe 1 et 2 et n’ont pas montré de signes caractéristiques de la gourme (vert).

La température de tous les chevaux est contrôlée quotidiennement. Dès que l’un d’eux affiche de l’hyper­thermie, il doit être déplacé vers le groupe 1.

Dans la mesure du possible, le matériel nécessaire aux soins ou à la nourriture des chevaux (seaux, abreuvoirs, mangeoires, licols, etc.) est dédié à chaque groupe. Si cela n’est pas possible, les éléments sont déplacés du groupe avec le moins de risque (groupe 3, vert) vers celui le plus de risqué (groupe 1, rouge). Le circuit du personnel doit se dérouler dans le même sens : zone verte, jaune puis rouge.

Les animaux porteurs de S. equi sont difficiles à détecter et un résultat négatif en culture sur un seul lavage ou écouvillon naso-pharyngé (ENP) ne prouve pas l’absence d’infection.

Trois ENP consécutifs sur une période de 2 semaines augmentent la chance de détecter un porteur. Les porteurs établis (confirmés), cependant, peuvent ne pas être détectés par les cultures d’ENP répétées pendant 2 à 3 mois. Bien que ces mesures soient chronophages, spécialement en période de compétition, elles sont essentielles pour réduire l’incidence de la gourme.

Protocoles proposés par l’Animal Health Trust [9, 16].

Photo 1. Tubes de sang pour analyses hématologiques.

Figure 1 : Procédure de quarantaine pour un nouvel animal entrant dans un effectif

Elisa : immunomigration et enzyme linked immunosorbent assay ; PCR : polymerase chain reaction ou réaction de polymérisation en chaîne ; ENP : écouvillonnage naso-pharyngé profond. D’après [16].

Figure 2 : Courbes PCR caractéristiques de l’amplification du gène seeI, spécifique de S. equi

PCR : polymerase chain reaction ; δRn : fluorescence ; ligne rouge : ligne de seuil ; ligne verte : témoin négatif. D’après le laboratoire Frank Duncombe.

Photos 2a et 2b. Colonies de S. equi. 2a. Après observation microscopique à la suite d’une coloration de Gram, grossissement × 1 000 ; 2b. Sur gélose Columbia au sang de mouton.

Photos 2a et 2b. Colonies de S. equi. 2a. Après observation microscopique à la suite d’une coloration de Gram, grossissement × 1 000 ; 2b. Sur gélose Columbia au sang de mouton.

Photo 3. Plaque obtenue après l’arrêt de la réaction colorimétrique, dernière étape du test iElisa.

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