Pratique vétérinaire équine n° 177 du 01/01/2013

Article de synthèse

Isabelle Barrier-Battut

Institut français du cheval et de l’équitation,
École nationale professionnelle des Haras,
La Jumenterie du Pin
61310 Exmes

Les techniques de collecte et de traitement de la semence évoluent sans cesse afin d’améliorer le rendement de la reproduction assistée. Cet article présente les dernières nouveautés dans ce domaine.

Résumé

Les techniques de concentration de la semence d’étalon évoluent et un filtre est maintenant disponible sur le marché, qui permet d’éliminer le plasma séminal sans centrifugation. Le facteur limitant reste le coût, 80 € par filtre, réutilisable une dizaine de fois pour le même étalon.

Des techniques de centrifugation sur colloïdes permettent une certaine sélection des spermatozoïdes, en triant une partie des cellules peu mobiles ou présentant des anomalies. Les principaux inconvénients restent le coût et le faible rendement : environ 40 % en moyenne de spermatozoïdes récupérés. Bien que l’intérêt de cette méthode soit discutable par rapport à une augmentation du nombre total de spermatozoïdes par insémination lorsque la qualité de la semence est médiocre, elle pourrait être utile pour sélectionner les plus aptes à supporter la réfrigération ou la congélation.

D’après une étude sur 12 étalons, la collecte de semence au sol ne modifie pas la mobilité des spermatozoïdes, par rapport à la collecte sur mannequin, mais fait diminuer de 20 %, en moyenne, le nombre de spermatozoïdes obtenus. Le poids supporté par les membres postérieurs pendant la collecte ne diffère pas entre les deux techniques.

Summary

Collection and treatment of stallion semen: what’s new?

Concentration techniques for stallion semen are being developed and a filter is now available on the market, which can eliminate the seminal plasma without centrifugation. The limiting factor is the cost, at 80 € per filter, reusable a dozen times for the same stallion.

Centrifugation techniques on colloids allow some sperm selection, sorting some of the less mobile or those with abnormalities. The main disadvantages are cost and low efficiency: about an average 40% of sperm are recovered. Although the advantage of this technique is questionable compared to an increase in total sperm per insemination when semen quality is poor, it could be useful to select the sperm most likely to support refrigeration or freezing.

According to a survey in 12 stallions, semen collection in the standing horse does not alter sperm motility compared to the collection against a dummy mare, but the average number of sperm produced is reduced by 20%. The weight supported by the hind limbs during collection did not differ between the two techniques.

Key words

Stallion, semen, centrifugation, capacitation

Bien qu’aucune découverte majeure n’ait été faite sur l’étalon depuis quelques années, certaines innovations techniques apparaissent, qui ont fait l’objet d’une synthèse lors du dernier symposium international sur l’étalon (6th International Symposium on Stallion Reproduction, Vienne, Autriche, 6-7 septembre 2012).

Techniques de concentration et de sélection des spermatozoïdes

La préparation des doses d’insémination artificielle consiste, entre autres, à diluer la semence pour obtenir un nombre de spermatozoïdes d’au moins 200 millions par dose, avec un volume maximal de un tiers de sperme pur pour deux tiers de dilueur. Le volume de la dose doit être de 20 ml au maximum (entre 10 et 20 ml). Certains étalons produisent une semence très peu concentrée (moins de 60 millions de spermatozoïdes/ml) et le respect de ces règles de dilution complique un peu la technique de préparation des doses d’insémination.

Pour obtenir un éjaculat plus concentré, il est possible d’intervenir sur les conditions de collecte : limiter les sources d’excitation de l’étalon, collecter “à vagin ouvert” pour ne garder que la première fraction, la plus riche en spermatozoïdes. Parfois, cela ne suffit pas. Une solution alternative consiste à effectuer une première dilution au tiers, puis à centrifuger la semence et à suspendre de nouveau le culot de spermatozoïdes dans un plus petit volume de dilueur, le volume étant calculé pour ajuster la concentration.

Cette technique est également utilisée pour éliminer le plasma séminal, chez certains étalons, lorsqu’il contient des substances toxiques pour les spermatozoïdes pendant la conservation à l’état réfrigéré. Dans la majorité des cas, la congélation de la semence inclut également une étape de concentration par centrifugation.

La centrifugation présente plusieurs inconvénients. Tout d’abord, elle nécessite d’être équipé d’une centrifugeuse, ce qui n’est pas le cas de tous les centres de collecte de semence. La centrifugation peut également provoquer des chocs mécaniques sur les spermatozoïdes. Enfin l’élimination du surnageant doit être réalisée avec précaution et assez rapidement sans provoquer de turbulences, au risque de perdre une grande partie des spermatozoïdes. La force et la durée optimales sont de 600 G pendant 10 minutes.

Pour limiter ces inconvénients, deux solutions alternatives sont possibles : la centrifugation sur “coussin”, développée depuis plusieurs années, et, plus récemment, la concentration des spermatozoïdes sans centrifugation, à l’aide d’un filtre spécialement destiné à cet effet.

Concentration par centrifugation sur coussin

Plusieurs coussins existent sur le marché : Maxifreeze® (IMV Technologies, L’Aigle, France), CushionFluid® (Minitube, Allemagne). Ils sont tous constitués d’une solution d’iodixanol à introduire délicatement dans le fond du tube contenant déjà la semence. La centrifugation est ensuite un peu plus longue et plus forte que classiquement : 1 000 G pendant 20 minutes. La densité du liquide de centrifugation permet aux spermatozoïdes de flotter à la surface du coussin, qui a la particularité d’être très peu visqueux, au lieu d’être plaqués au fond du tube par la force centrifuge. Ils sont également “englués” par la viscosité du liquide, ce qui empêche leur remontée dans le surnageant. Les pertes de spermatozoïdes dans le surnageant sont donc très faibles, ce qui est intéressant pour optimiser le nombre de paillettes de sperme congelé produites par les étalons “petits producteurs”. Les inconvénients sont le surcoût par rapport à une centrifugation classique, la perte de temps (la durée de centrifugation passe de 10 à 20 minutes) et le fait que la manipulation est délicate et demande de la pratique. Le coussin n’est pas réutilisable.

Ces inconvénients seraient compensés par l’augmentation du rendement. En effet, le stock de spermatozoïdes est atteint plus rapidement ce qui diminue les coûts annexes (pension, etc.).

Concentration par filtration

L’équipe de recherche de l’université de Botucatu, au Brésil, a développé un filtre permettant de concentrer les spermatozoïdes et d’éliminer une grande partie du plasma séminal sans centrifugation [1]. SpermFilter® (Nidacon, Suède, distribué en France par JCD, 69350 La Mulatière, www.laboratoires-jcd.com) se présente sous la forme d’une coupelle ronde d’environ 10 cm de diamètre, dont le fond est recouvert d’une membrane poreuse (pores de 2 µm). Après avoir dilué un volume de sperme pur dans un volume de dilueur, la suspension de spermatozoïdes est versée dans cette coupelle placée au-dessus d’une boîte de Pétri, le tout étant maintenu sur une platine chauffante à 36 °C (photo). Des mouvements de rotation lente sont ensuite imprimés au filtre, afin que le plasma séminal et le dilueur passent à travers les pores, les spermatozoïdes restant au-dessus du filtre. Lorsqu’il ne reste qu’une petite quantité de liquide au-dessus du filtre, celle-ci est récupérée dans un récipient préalablement réchauffé à 36 °C. Le filtre est rincé à l’aide d’une petite quantité de dilueur afin de bien récupérer tous les spermatozoïdes. Cette technique est très efficace, mais présente deux inconvénients :

– la durée nécessaire pour la filtration : 5 à 10 minutes ;

– le coût : 80 € pour un filtre, réutilisable une dizaine de fois pour le même étalon, après rinçage à l’eau distillée stérile et séchage à 37 °C.

Sélection des spermatozoïdes

Depuis quelques années apparaissent sur le marché des colloïdes constitués de particules de silicates destinés à la préparation de gradients de densité sur lesquels est centrifugé le sperme : EquiPure® (Nidacon), AndroColl-E® (Minitube, Allemagne), RediGrad® (GE Healthcare, Suède, commercialisé uniquement dans un objectif de recherche). Ces colloïdes peuvent être utilisés sous forme de gradient de densité proprement dit : deux couches de colloïde de densité différente (EquiPure® Top Layer et EquiPure® Bottom Layer) ou une monocouche (EquiPure® Bottom Layer uniquement, ou AndroColl-E®). RediGrad® forme spontanément un gradient de densité lors de la centrifugation, en raison de l’hétérogénéité des particules de silicate.

Technique d’utilisation

Le sperme dilué (un volume de sperme pour un volume de dilueur) est déposé délicatement sur le colloïde dans un tube conique de 15 ou 50 ml, puis l’ensemble est centrifugé à 300 G pendant 20 minutes. Durant la centrifugation, le plasma séminal, les éventuels débris et les particules de dilueur (jaune d’œuf, glycérol, etc.), ainsi que les bactéries sont retenus en haut du colloïde, tandis que seuls les spermatozoïdes traversent le colloïde pour former un culot au fond du tube. Ils sont ainsi “lavés”. Une certaine sélection des spermatozoïdes s’opérerait également. Plusieurs publications ont montré que les spermatozoïdes mobiles et sans anomalie morphologique étaient majoritairement entraînés dans le culot de centrifugation, tandis qu’un certain nombre de spermatozoïdes immobiles, anormaux, ou présentant des altérations de la chromatine restaient entrappés dans le colloïde (figure 1) [6].

EquiPure® est indiqué préférentiellement pour les petits volumes de semence (par exemple étalon oligospermique ou sperme congelé). De 0,5 à 3 ml de sperme pour 3 ml d’EquiPure® sont placés dans un tube conique de 10 ou 15 ml. AndroColl® est indiqué pour les grands volumes : jusqu’à 15 ml de sperme dilué (il convient d’ajuster le volume pour une concentration d’environ 100 millions de spermatozoïdes/ml) et 15 ml d’AndroColl® dans un tube conique de 50 ml. Il existe réellement une différence de formulation entre les deux produits, qui permet une bonne efficacité d’AndroColl® pour les grands volumes de semence. Le fabricant d’EquiPure® fournit une abaque des volumes respectifs de sperme et d’EquiPure® à utiliser selon la concentration du sperme initial. Il convient de ne pas dépasser 1 000 × 10® spermatozoïdes pour 3 ml d’EquiPure®. Toutefois, son efficacité pour des volumes de sperme supérieurs à 5 ml est controversée, le rendement risquant de diminuer.

Après élimination du surnageant, les spermatozoïdes du culot sont suspendus à nouveau dans une quantité appropriée de dilueur. Cette technique enrichirait la semence en spermatozoïdes de bonne qualité, en éliminant les défectueux. Cette sélection peut être utilisée :

– immédiatement après la récolte, afin de sélectionner les spermatozoïdes les plus aptes à supporter la réfrigération ou la congélation (tableau 1) ;

– après conservation, afin d’augmenter le pourcentage de spermatozoïdes mobiles dans les doses d’insémination. Lors de conservation prolongée, un tri toutes les 24 heures permet d’éliminer à chaque fois un certain nombre de spermatozoïdes défectueux [6]. Toutefois, ce tri s’accompagne d’une diminution du nombre de cellules.

Pour optimiser le tri des spermatozoïdes, plusieurs précautions importantes sont à prendre :

– disposer d’une interface franche entre le colloïde et la semence. Contrairement au coussin, le colloïde doit être placé d’abord au fond du tube, puis le sperme dilué ajouté avec précaution au-dessus ;

– ne pas déposer un trop grand volume de semence ou un nombre trop élevé de spermatozoïdes par tube, car le rendement diminue fortement. Il est préférable d’utiliser des tubes de 15 ml, avec un minimum de 3 ml de colloïde pour 1 000 millions de spermatozoïdes. Pour les grands volumes de semence peu concentrée, AndroColl-E® propose une formulation spécifique permettant d’utiliser jusqu’à 15 ml de sperme et 15 ml de colloïde, en tube de 50 ml. Mais la concentration doit être voisine de 100 millions de spermatozoïdes/ml. Une concentration trop élevée est associée à un plus faible rendement.

Pour le sperme très peu concentré et de faible qualité, il est possible d’associer la filtration sur SpermFilter®, puis la centrifugation sur colloïde. Cela permet une première concentration de l’éjaculat, donc une réduction du volume déposé sur le colloïde. Il convient de ne pas trop concentrer le sperme déposé sur le colloïde, car c’est l’effet inverse (faible rendement après centrifugation) qui est obtenu. La concentration optimale avant dépôt sur le colloïde est autour de 100 millions de spermatozoïdes par millilitre.

Pour les étalons présentant un taux très élevé d’anomalies morphologiques (en particulier des têtes seules), le gradient de densité pourrait se révéler plus efficace que le colloïde monocouche [6].

Inconvénients

Les principaux inconvénients de cette technique sont :

– le coût : EquiPure® (Bottom Layer) est vendu 98 € hors taxes (HT) les 100 ml ou 50 € HT les deux flacons de 20 ml. EquiPure® Top Layer n’est plus commercialisé. AndroColl® (correspondant à la formulation “large”) est vendu 75,60 € HT les 250 ml. Ces produits ne sont pas réutilisables ;

– le faible rendement : 15 à 60 % des spermatozoïdes initiaux sont récupérés, selon les publications. Ce rendement varie selon la qualité initiale du sperme. Si les spermatozoïdes de mauvaise qualité sont éliminés, le nombre de spermatozoïdes utilisables est alors largement inférieur au nombre initial, et cela d’autant plus que le premier échantillon est de mauvaise qualité. Il est donc possible de s’interroger sur l’intérêt d’une telle sélection, par rapport à l’insémination avec un nombre plus élevé de spermatozoïdes totaux.

Applications principales

• Plusieurs arguments seraient en faveur d’une sélection des spermatozoïdes “de bonne qualité” avant conservation ou même avant insémination : les spermatozoïdes altérés libèrent des radicaux libres pouvant être toxiques pour les autres spermatozoïdes pendant le stockage à 4 °C, voire ensuite dans le tractus génital femelle [5]. Les spermatozoïdes présentant des altérations de la chromatine ont souvent une mobilité normale et pourraient entrer en compétition avec les spermatozoïdes normaux pour la fécondation, mais provoquer ensuite un arrêt du développement embryonnaire [6]. La centrifugation sur gradient de densité permet de diminuer la proportion de spermatozoïdes à chromatine altérée, donc pourrait limiter ce problème. Des études comparatives de fertilité avec des spermatozoïdes triés ou non, à nombre égal de spermatozoïdes “de bonne qualité” par insémination, seraient nécessaires pour clarifier ces hypothèses.

• Il est communément admis que la semence congelée doit, pour être jugée apte à l’insémination, présenter un minimum de 35 % de spermatozoïdes mobiles rapides à la décongélation. Pour certains étalons présentant une médiocre qualité de semence à la récolte, la sélection des spermatozoïdes avant congélation pourrait augmenter le nombre d’éjaculats dépassant le seuil de 35 % de mobilité après décongélation, donc commercialisables (figure 2).

Collecte de semence sur l’étalon au sol ou sur mannequin

L’équipe du Haras national d’Avenches (Suisse) a éduqué 12 étalons franches-montagnes à la collecte de semence au sol, à l’aide d’un dispositif particulier fixé à l’arrière de la barre de contention de la jument. L’expérimentation proprement dite s’est ensuite déroulée sur 10 jours, avec deux récoltes par jour : au sol et sur mannequin [6].

Dans cette étude, la qualité de semence a été identique entre les deux techniques. En revanche, la récolte au sol a été associée à une diminution de 20 %, en moyenne, du nombre de spermatozoïdes dans l’éjaculat, par rapport à la collecte sur mannequin (tableau 2). Cette donnée doit être prise en compte dans la décision de collecter un étalon au sol.

À l’aide d’une balance placée sous les membres postérieurs de l’étalon, il a également été possible d’évaluer le poids supporté par l’arrière-main pendant la collecte. À part une augmentation très transitoire de poids au moment de la montée sur le mannequin, la charge supportée par les membres postérieurs pendant la collecte de semence ne diffère pas significativement entre les deux techniques. Bien que des effets biomécaniques ne puissent pas être exclus, cette étude ne permet donc pas de montrer un impact bénéfique de la collecte de semence au sol, chez des chevaux ne présentant pas de contre-indication formelle à la collecte sur mannequin (troubles sévères de l’équilibre ou cicatrice abdominale fragile, par exemple).

Fécondation in vitro : des avancées modestes dans la compréhension des mécanismes

Le premier poulain au monde issu d’une fécondation in vitro est né dans l’unité de reproduction équine de l’Institut national de recherche agronomique de Tours-Nouzilly en 1990. Depuis cette date, les résultats de la fécondation in vitro dans le monde ont toujours été inconstants, y compris au sein d’un même laboratoire. L’un des points d’achoppement est la réalisation de la capacitation des spermatozoïdes, difficile à obtenir in vitro. K. Hinrichs (université du Texas) a présenté une synthèse sur les récentes avancées dans ce domaine [2]. Les travaux anciens se focalisaient sur la réaction acrosomique. Or l’acquisition de la mobilité hyperactivée est également très importante et régulée chez le cheval d’une manière différente des autres espèces. Il est maintenant démontré que la capacitation des spermatozoïdes peut être obtenue en milieu simple, contenant des bicarbonates, sans nécessité d’induire la réaction acrosomique de façon artificielle. Mais la régulation précise du pH et de la concentration en spermatozoïdes est très importante, car les réactions enzymatiques indispensables à la capacitation (phosphorylation des tyrosines) ne se font pas avec un pH inférieur à 7,8 et une concentration supérieure à 10 × 106 spermatozoïdes/ml. En maîtrisant parfaitement ces paramètes, il devrait être possible d’obtenir la capacitation des spermatozoïdes in vitro de manière plus reproductible.

Conclusion

Les innovations techniques récentes, telles que la concentration des spermatozoïdes par filtration et la centrifugation sur gradient de densité facilitent la gestion de certains étalons subfertiles, comme ceux qui présentent une semence faiblement concentrée, voire une oligo-asthénospermie.

Elles pourraient également augmenter le rendement de la congélation de la semence chez les étalons dont la plupart des éjaculats sont à la limite du seuil de congélabilité (35 % de spermatozoïdes mobiles à la décongélation).

Références

  • 1 – Alvarenga MA, Papa FO, Carmo MT et coll. Methods of concentrating stallion semen. J. Equine Vet. Sci. 2012;32:424-429.
  • 2 – Hinrichs K. Hyperactivated sperm motility : are equine sperm different ? J. Equine Vet. Sci. 2012;32:441-444.
  • 3 – Maziero RRD, Papa PM, Hartwig FP et coll. Effects of single layer density gradient centrifugation on cooled-stored stallion semen. J. Equine Vet. Sci. 2012;32:496.
  • 4 – Meroni G, Sieme H, Burger D. Efficiency of ground semen collection in the stallion. J. Equine Vet. Sci. 2012;32:497.
  • 5 – Morrell JM, Winblad C, Johannisson A. Production of reactive oxygen species is lower in stallion spermatozoa after single layer centrifugation with Androcoll-E. J. Equine Vet. Sci. 2012;32:500.
  • 6 – Morrell JM. Stallion sperm selection : past, present, future. J. Equine Vet. Sci. 2012;32:436-440.
  • 7 – Papa PM, Maziero RRD, Hartwig FP et coll. Effect of density gradient on sperm parameters of stallion frozen semen. J. Equine Vet. Sci. 2012;32:505.

Conflits d'intérêts

Aucun.

Éléments à retenir

> Il existe maintenant un filtre permettant de concentrer la semence sans la centrifuger.

> Des préparations permettant de trier partiellement les spermatozoïdes “de bonne qualité” par centrifugation sur gradient de densité sont disponibles.

> La collecte de semence au sol ne modifie pas la mobilité des spermatozoïdes par rapport à la collecte sur mannequin, mais fait diminuer de 20 % en moyenne le nombre de spermatozoïdes obtenus. Le poids moyen supporté par les membres postérieurs pendant la collecte ne diffère pas entre les deux techniques.

Photo 1. Filtre SpermFilter

Figure 1 : Lavage et sélection des spermatozoïdes par centrifugation sur colloïde : technique monocouche

Figure 1 : Lavage et sélection des spermatozoïdes par centrifugation sur colloïde : technique monocouche

Figure 2 : Les différentes techniques de centrifugation de la semence : intérêt et inconvénients

Figure 2 : Les différentes techniques de centrifugation de la semence : intérêt et inconvénients

Tableau 1 : Effet de la sélection des spermatozoïdes par EquiPure® avant la conservation à l’état réfrigéré ou la congélation

Tableau 1 : Effet de la sélection des spermatozoïdes par EquiPure® avant la conservation à l’état réfrigéré ou la congélation

Tableau 2 : Caractéristiques de la semence obtenue par collecte sur mannequin ou au sol(1)

Tableau 2 : Caractéristiques de la semence obtenue par collecte sur mannequin ou au sol(1)
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