Le point Vétérinaire n° 293 du 01/03/2009
 

DIAGNOSTIC DE LA MALADIE DES MUQUEUSES

Infos

FOCUS

Claudine Fouère-Gueguen*, Alain Lacourt**, Éric Le Dréan***


*LDA 35
24, rue Antoine-Joly
35031 Rennes
**LDA 35
24, rue Antoine-Joly
35031 Rennes
***LDA 35
24, rue Antoine-Joly
35031 Rennes

Le manque de sensibilité parfois observé est plus souvent lié au réactif utilisé qu’aux pratiques de laboratoire.

Pour la première fois en France, un essai interlaboratoires (EIL) sur le dépistage de la maladie des muqueuses (BVD) a été organisé en 2008. Orchestré par le Laboratoire départemental d’analyses d’Ille-et-Vilaine (LDA 35), il vise les méthodes de dépistage par Elisa : recherches d’anticorps et d’antigènes dans le sérum et d’antigènes dans les leucocytes. 62 laboratoires ont accepté de participer à cet essai.

Au-delà des enseignements directs obtenus, la démarche illustre la mobilisation d’une filière pour améliorer la qualité.

Une suite logique

Le LDA 35 a acquis depuis plusieurs années une importante expérience dans le domaine du diagnostic de la BVD. En effet, le contexte régional de mise en place d’un plan de maîtrise collective de cette maladie par les éleveurs a rapidement soulevé des interrogations sur les fiabilités absolue et relative des différentes méthodes de diagnostic de cette affection. Pour commencer à y répondre, le LDA 35 a choisi, en partenariat avec les producteurs de kit Elisa, de mettre en place une collection d’échantillons de statut connu. À cet effet, en 2006, plusieurs centaines de bovins ont été testés par les méthodes de référence (séroneutralisation et isolement viral sur culture). Certains ont été prélevés afin de conserver le sérum, le sang total et les leucocytes (éventuellement le lait). Cette collection a dans un premier temps servi à évaluer les différents tests Elisa présents sur le marché français. Au cours de ces travaux préliminaires, un échantillon de référence a été constitué (tous les réactifs doivent le trouver positif). Il est dorénavant commercialisé sous forme lyophilisée (LDA 35).

Disposant de cette collection, le LDA 35 a réalisé plusieurs études d’évaluation de réactifs en 2006 et 2007 sur les techniques Elisa et PCR [1].

Dans la suite logique de cette activité d’expertise, le LDA 35 a souhaité organiser un EIL dont l’objectif est d’évaluer les performances de chaque laboratoire (combinaison de sa technicité et des qualités intrinsèques des réactifs).

Trois options, quatre évaluations

Trois options ont été offertes aux laboratoires :

- dépistage des anticorps dirigés contre le virus de la BVD dans le sérum ;

- dépistage des antigènes du virus de la BVD dans le sérum ;

- dépistage des antigènes du virus de la BVD dans les leucocytes.

Chaque participant a reçu entre 15 et 20 échantillons permettant d’évaluer la spécificité sur 5 échantillons, la sensibilité sur 5 échantillons, la loi dose-effet sur 3 dilutions d’un même échantillon et la répétabilité avec 3 échantillons dupliqués.

Les échantillons positifs et négatifs servant à évaluer la sensibilité et la spécificité ont été sélectionnés dans la collection pour fournir des résultats de niveaux différents, mais non ambigus.

Une telle évaluation reste très grossière. Dans les règles de l’art, le calcul de la sensibilité nécessite plusieurs centaines d’échantillons positifs provenant de zones géographiques différentes pour tenir compte de la variabilité antigénique des souches de BVD, et celui de la spécificité, plusieurs milliers d’échantillons négatifs [2, 3].

Le choix des trois dilutions a été effectué afin d’obtenir une réponse positive avec tous les réactifs pour la dilution la plus faible et une réponse négative avec tous les réactifs pour la plus forte.

Ces échantillons ont tous été testés par le LDA 35 avant envoi pour déterminer les résultats attendus avec tous les réactifs (pour le dépistage des anticorps : tableau complémentaire 1 sur www.WK-Vet.fr).

Insuffisance d’un réactif par essai

Les 62 laboratoires participants ont répondu dans les délais impartis (15 jours).

Aucune inversion de tubes n’a été mise en évidence. Un seul laboratoire a commis une erreur de transcription sur 117 réponses (liste des critères non satisfaisants : encadré).

Les principales causes de non-conformité des résultats qualitatifs portent sur la sensibilité (9 résultats sur 117, soit 7,7 %). Aucun défaut de spécificité n’est constaté (tableaux 2, 3 et complémentaire 4 sur www.WK-Vet.fr). Le manque de sensibilité est davantage lié à un défaut des réactifs qu’à un défaut de maîtrise des laboratoires.

Dans chaque EIL, un réactif pose des difficultés : le kit E pour le dépistage des anticorps dans le sérum, le kit B pour celui des antigènes dans le sérum et le kit E pour celui des antigènes dans les leucocytes. L’origine du défaut de sensibilité est variable.

Une analyse de la loi dose-effet et une analyse quantitative, notamment sur la répétabilité, ont également été fournies aux laboratoires participants, leur permettant de se positionner les uns par rapport aux autres.

Des voies de progrès

Cet EIL devrait contribuer à améliorer rapidement la fiabilité du diagnostic de la BVD. Une prise de conscience des différents acteurs est nécessaire (9 sur 117 réponses avec un défaut de sensibilité, soit 7,7 %).

Il prouve à certains fournisseurs la nécessité d’améliorer leur kit (modification du seuil, des dilutions échantillons). Des laboratoires ont également été conduits à analyser les causes de leur manque de répétabilité et à mettre en place des actions correctives.

Le laboratoire organisateur possède maintenant des données améliorant sa connaissance des échantillons de sa collection (photo).

D’autres EIL pourraient ainsi voir le jour, notamment sur le dépistage du virus BVD par polymerase chain reaction et sur celui des anticorps dirigés contre le virus de la BVD dans le lait.

  • (1) Les échantillons sont issus de la collection de référence du LDA 35 mise en place en collaboration avec le Syndicat de l’industrie du médicament vétérinaire et réactif. Les statuts des échantillons ont été déterminés sur la base de données épidémiologiques associées à des résultats d’analyses obtenus par les méthodes de référence (séroneutralisation et isolement viral en culture cellulaire).

Références

  • 1 - Fouere-Gueguen C, Le Drean E. Élaboration d’une méthodologie pour l’évaluation de réactifs de type “Antigénémie DVB”. Présentation orale atelier Adilva aux Journées nationales des GTV, Nantes, mai 2007.
  • 2 - Jacobson RH. Validation of serological assays for diagnosis of infectious diseases. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1998;17:469-486.
  • 3 - Vilcek S, Durkovic B, Kolesavora M. Genetic diversity of BVDV : consequences for classification and molecular epidemiology. Prev. Vet. Med. 2005;72:31-35.

Encadré : Critères de non-satisfaction pour les résultats obtenus

• Toute mise en évidence d’une inversion de tubes.

• Toute erreur de transcription.

• Tout délai supérieur à 15 jours entre la réception de colis et l’envoi des résultats.

• Toute erreur par excès : tous les échantillons dont le statut réel(1) est négatif doivent fournir une réponse qualitative négative.

• Toute erreur par défaut : tous les échantillons dont le statut réel(1) est positif doivent fournir une réponse qualitative positive.

• Tout résultat non satisfaisant dans l’appréciation de la loi dose-effet ; cette loi s’apprécie par une gamme de dilutions. Les réponses quantitatives (données calculées servant à l’interprétation) doivent évoluer de la positivité vers la négativité dans le sens des dilutions croissantes, sans inversion des réponses.

• Une mauvaise répétabilité pour les échantillons répétés. Les réponses quantitatives seront évaluées par rapport à l’ensemble des résultats fournis par les laboratoires pour un réactif donné.

Grâce à la banque d’échantillons, d’autres essais pourraient voir le jour, par PCR (polymerase chain reaction) notamment.

Tableau 2 : Résultats par kit pour le dépistage des anticorps dirigés contre le virus BVD dans le sérum

Tableau 3 : Résultats par kit pour le dépistage des antigènes du virus BVD dans le sérum