Le point Vétérinaire n° 284 du 01/04/2008
 

Reproduction du chien

Pratique

Pas à pas

Émilie Rosset*, Samuel Buff**


*CERREC, pathologie de la reproduction, ENV de Lyon
1, avenue Bourgelat, 69280 Marcy-L'Étoile

Le spermogramme permet l’analyse quantitative et qualitative du sperme.

Le spermo(cyto)gramme correspond à l’analyse du sperme : il comprend l’analyse des propriétés physico-chimiques de la semence, et celle de la mobilité, de la morphologie et la numération des spermatozoïdes (spz) [3]. Afin de pouvoir réaliser une analyse complète, il convient d’avoir récolté les trois phases de l’éjaculat, si possible dans trois tubes distincts, afin de pouvoir contrôler le pH, le volume et la couleur de chaque fraction [1].

Pour la majorité des auteurs, une dose inséminante s’entend sur la base d’au moins 100 à 150 x 106 de spz normaux et mobiles [1, 2, 3]. Toutefois, la numération en spz varie d’un chien à l’autre (hétérogénéité raciale en particulier) ou d’un éjaculat à l’autre [3]. Le nombre de spz est fonction de la taille du chien ; en moyenne, par éjaculat, il est de 250 millions environ pour un petit chien, de 750 millions environ pour un chien moyen ou grand, de 1 à 3 milliards pour un chien de taille géante.

Même s’il n’existe pas de relation directe entre la mobilité de la semence et la fertilité, celle-ci doit être supérieure à 50 % pour une semence utilisée fraîche et à 70 % pour une semence réfrigérée ou congelée pour que le pronostic de gestation demeure raisonnable [1].

Le taux d’anomalies (défauts morphologiques) ne doit pas excéder 30 %, car les spz altérés diminuent le pouvoir fécondant de la semence [2]. L’avenir du chien comme reproducteur est fonction du type d’anomalies. Les déviations latérales de la tête, les enroulements du flagelle ou la présence de gouttelettes proximales en regard de la pièce intermédiaire sont des altérations dites primaires, c’est-à-dire d’origine testiculaire. Si plus de 10 % d’entre elles sont observées, le pronostic reproducteur est limité à long terme. C’est le cas de chiens âgés dont le spermogramme comporte un grand nombre de gouttelettes proximales, signe de dégénérescence testiculaire [3]. Des gouttelettes observées en région distale de la pièce intermédiaire, des décapitations ou des pièces intermédiaires coudées sont le signe d’anomalies secondaires, qui correspondent à un défaut de maturation épididymaire ou à une altération lors du stockage. Ce type d’anomalies est fréquemment rencontré chez des chiens qui n’ont pas éjaculé depuis longtemps. La qualité de l’éjaculat s’améliore habituellement avec la régularité des prélèvements [3].

Le clinicien ne doit jamais conclure à une infertilité sur la base d’un seul examen. Il est conseillé de renouveler les prélèvements 10 à 15 jours, puis 70 à 90 jours après le premier spermogramme, car un cycle de spermatogenèse doit avoir lieu avant de recourir à d’éventuelles investigations invasives [1, 3]. De plus, il existe des artefacts dus aux prélèvements et aux manipulations.

Le spermogramme est un examen prédictif qui ne peut être utilisé seul pour confirmer le devenir d’un chien comme reproducteur.

1 Récolte des trois phases lors de l’éjaculation(1)

Lorsque le fractionnement n’a pas pu être réalisé au moment du prélèvement ou qu’une contamination de la fraction spermatique par la phase prostatique est constatée, une centrifugation modérée du prélèvement 720 x g pendant 5 minutes permet de séparer les éléments cellulaires sans les endommager.(1) Voir l’article “Le prélèvement de semence chez le chien”, du même auteur dans Point Vét. 2008 ;39(282) :58-59.

2 Dépôt de la phase spermatique

À l’aide d’une pipette Pasteur, une goutte (au moins 20 µl) de fraction spermatique est déposée sur une lame en verre préalablement réchauffée (une platine chauffante). La mobilité et la progressivité des spermatozoïdes sur la lame (proportion de spz ayant une bonne mobilité fléchante) sont estimées. Cette étape permet aussi, avec l’habitude, d’évaluer la concentration et de choisir le meilleur facteur de dilution pour la réalisation de la numération.

3 Mélange du colorant (éosine/bleu d'aniline)

L’analyse morphologique est réalisée après coloration à l’éosine/bleu d’aniline et étalement sur lame. Une goutte de colorant est mise en contact avec un goutte de fraction spermatique (45 secondes) et mélangée avec précaution. La goutte de sperme utilisée pour l’examen de la mobilité peut être récupérée pour la réalisation de la coloration, si l’estimation de la concentration semble insuffisante.

4 Étalement de l’éosine/bleu d’aniline

Le mélange semence-colorant est étalé par capillarité sur une lame dégraissée, comme un frottis sanguin. La lecture doit être réalisée rapidement, car la cristallisation du colorant rend la visualisation des anomalies plus difficile. Cent à deux cents spz au moins sont comptés afin de dénombrer les formes anormales et de différencier les anomalies.

5 Exemples de spermatozoïdes normaux

Un spz normal est constitué de quatre parties : la tête, le col, la pièce intermédiaire et le flagelle, et mesure environ 65 µm. Les différents éléments doivent être correctement proportionnés, ne pas être coudés ni présenter des renflements, sinon ils sont anormaux.

6 Exemples d’anomalies de la pièce intermédiaire

Les anomalies sont faciles à reconnaître avec un peu d’expérience. Ici, deux spz avec leur pièce intermédiaire coudée sont observés.En cas de forte proportion de spz décapités, il convient de refaire le spermogramme car ces anomalies peuvent être liées à l’étalement.

7 Exemples d’anomalies de la tête et du flagelle

Ici, un grand nombre de flagelles enroulés sont visualisés. Un spz à deux têtes ou encore un spz décapité sont observés. Lors de décapitation, il convient de compter les têtes ou les flagelles, mais pas les deux ensemble.

8 Matériel nécessaire à la numération

À l’aide d’un dilueur de Potain ou d’une pipette de précision, la semence est diluée avec du NaCl à 3 % (par exemple 10 µl de phase 2 dans 900 µl de NaCl à 3 %). Ensuite, elle est déposée sur la cellule hématimétrique sous sa lamelle. Le mélange diffuse sur la grille de comptage par capillarité. Il est préconisé d’attendre quelques minutes que les spz décantent avant d’effectuer le comptage au microscope.

9 Exemple d’une zone de lecture (cellule de Thoma)

Il convient de compter les spz en regard de cinq grands carrés. Une formule adaptée à chaque type de cellule hématimétrique permet de calculer la concentration selon le nombre de spz comptés et du facteur de dilution utilisé. Ici, la zone de comptage est en gris et noir : neuf spz apparaissent. Les deux cercles rouges représentent des spz à ne pas comptabiliser car leur tête n’est pas contenue dans la zone grisée.