Le point Vétérinaire n° 275 du 01/05/2007
 

Affections respiratoires des jeunes bovins

Pratique

PAS À PAS

Ellen Schmitt-van de Leemput*, Engeline van Duijkeren**


*Clinique vétérinaire, 53700 Villaines-la-Juhel, France
**Veterinary Microbiological Diagnostic Center, Département
de bactériologie, École vétérinaire d’Utrecht, Pays-Bas

Identifier P. multocida et M. haemolytica justifie une antibiothérapie et explique les échecs vaccinaux.

Des techniques de bactériologie classique peuvent être réalisées sur des sécrétions respiratoires au cabinet vétérinaire. Une méthode simple est décrite dans cet article. Elle est fiable sur des échantillons prélevés par écouvillonnage profond à l’échelle collective des animaux malades (1).

Elle comporte deux volets :

- une identification primaire sur trois milieux de culture différents, identiques à ceux utilisés pour le lait (tableau) [11] ;

- puis, une confirmation par trois testsou colorations (tableau complémentaire “Paramètres d’identification secondaire des bactéries de l’arbre respiratoire”). Cette étape est essentielle.

Outre les pipettes Pasteur, les öses, les milieux de culture et les réactifs, la réalisation des examens bactériologiques au cabinet nécessite de disposer d’un incubateur (prix à partir de 250€), d’où un prix par analyse de 4€ . Les méthodes présentées ont été validées en procédant à un examen bactériologique au laboratoire du centre de diagnostic microbiologiquevétérinaire de l’École vétérinaire d’Utrecht (VMDC, Pays-Bas) sur des souches identifiées comme Pasteurella multocida ou Mannheimia haemolytica. Un antibiogramme peut être réalisé ensuite(2).

  • (1) Voir l’article “L’écouvillonnage profond est-il fiable pour un prélèvement respiratoire ?” des mêmes auteurs dans ce numéro.

  • (2) Voir la fiche clinique, à paraître dans Le Point vétérinaire.

Remerciements au Dr Annie Schmitt-Beurrier.

1 Mise en culture Trois géloses différentes sont ensemencées : COS, ANC et BCP. Pour chacune, l’écouvillon est roulé sur lui-même près du bord (A), puis, avec une pipette Pasteur, trois ou quatre dents de scie sont dessinées (B), à partir du petit cercle initial (1), puis un peu en décalage (dilutions 2, 3, 4). Les géloses sont laissées en culture pendant 12 à 24 heures à 37 °C dans un incubateur.

2 Identification primaire : exemples de résultats Dans ces deux exemples, une bactérie montre une croissance sur COS (milieu le plus à droite sur les photos : gélose non spécifique contenant 5 % de sang de mouton [Colombia au sang]) mais pas sur ANC (gélose au sang additionnéee d’antibiotiques : acide nalidixique et colimycine) et BCP (milieu de culture sans sang, auquel a été ajouté du bromocrésol), comme c’est le cas pour Pasteurella multocida

2 Identification primaire : exemples de résultats Dans ces deux exemples, une bactérie montre une croissance sur COS (milieu le plus à droite sur les photos : gélose non spécifique contenant 5 % de sang de mouton [Colombia au sang]) mais pas sur ANC (gélose au sang additionnéee d’antibiotiques : acide nalidixique et colimycine) et BCP (milieu de culture sans sang, auquel a été ajouté du bromocrésol), comme c’est le cas pour Mannheimia haemolytica

3 Identification primaire : vue rapprochée d’une colonie de P. multocida sur COS Pasteurella multocida forme une grande colonie blanche qui a une odeur et une forme en goutte d’eau caractéristiques. Aucune hémolyse n’est observée.

4 Identification primaire : vue rapprochée d’une colonie de M. haemolytica sur COS avant enlèvement de quelques colonies Pour M. haemolytica, les colonies sont légèrement plus petites que pour P. multocida. Elles sont blanches à transparentes, rondes, avec une petite zone de β-hémolyse. Certaines colonies doivent être enlevées pour observer l’hémolyse.

5 Confirmation : test à la catalase Une goutte d’eau oxygénée est déposée sur une lame de verre porte-objets (A). Une colonie est prélevée à l’aide d’une pipette öse et déposée dans de l’eau oxygénée (B). Une effervescence traduit la dégradation de l’eau oxygénée en O2. Le germe est dit “catalase +” car il possède cette enzyme.

6 Coloration de Gram Pasteurella spp. et Mannheimia spp. sont de petits bâtonnets Gram- et catalase+. Le protocole de coloration de Gram suivant peut être utilisé : après fixation, la lame est immergée pendant une minute dans du violet de gentiane, rincée au lugol pendant une minute, puis à l’eau, décolorée dans de l’alcool acétone pendant 30 secondes et contre-colorée à la safranine pendant une minute.

7 Test à l’urée et réaction indol Avec une pipette öse, des colonies cultivées sont prélevées et diluées avec 0,5 ml d’un réactif à l’urée, puis incubées pendant 24 heures à 37 °C. Le test est positif quand le réactif passe de l’orange au rouge. P. multocida et M. haemolytica sont uréases-. Pour la réaction indol, l’opérateur ajoute dans le tube précédent 0,5ml de réactif Kovacs® et l'agite. Si le surnageant devient rouge, la réaction est positive. P. multocida est indol+ (sauf exception M. haemolytica est indol-) [3].

Tableau : Croissance de bactéries isolées de l’arbre respiratoire bovin sur trois milieux de culture

* Croissance uniquement si le milieu est enrichi en facteur V et en présence de CO2. À 24 heures, 37 °C, dans les conditions atmosphériques, les Pasteurella spp. ne croissent mal sur des milieux de culture sans sang (voir la dernière colonne : BCP). P. multocia et M. haemolytica croissent seulement sur le milieu COS, mais pas sur la gélose ANC car les antibiotiques empêchent la croissance des bactéries gram-.