Le point Vétérinaire n° 272 du 01/01/2007
 

GÉNÉTIQUE

Éclairer

NOUVEAUTÉS

Corinne Cherbonnel

6, rue des Sports
17000 La Rochelle

Les tests génétiques permettent l’identification irréfutable d’un animal. Ils facilitent la filiation et renseignent sur le taux de consanguinité chez les nouveau-nés.

La certification des filiations pour les espèces dites de “rente”, définie dans les années 1970, fait l’objet depuis 2000 d’un décret ministériel.

L’émergence de nouvelles technologies d’analyses massives et à haut débit de la structure et du fonctionnement des génomes ouvre l’ère de la génomique.

Deux défis majeurs sont à relever. Le premier tient à l’amélioration de la rentabilité de l’élevage, à l’acceptabilité des modes de conduite des animaux et à la qualité des productions. Le second défi concerne la gestion de la diversité génétique et l’amélioration génétique des animaux d’élevage. Au-delà d’une amélioration génétique fondée sur la mesure des performances des géniteurs et de leurs descendants, la gestion de la diversité génétique des espèces et des populations s’appuie sur l’identification directe des variants des gènes qui contribuent de façon importante au polymorphisme phénotypique (sensibilité ou résistance aux maladies, par exemple).

La Société centrale canine et le Livre officiel des origines félines mettent en place des bases de données pour permettre l’intégration d’informations génétiques (identification par ADN, absence de tares) et d’indices de performance des reproducteurs. Le but est d’offrir aux éleveurs un véritable outil de gestion des races, à l’instar de ce qui existe pour les espèces bovine et ovine.

Réalisation d’un prélèvement

• La qualité et le succès d’une analyse génétique dépendent de la qualité du prélèvement et de son identification. Le prélèvement doit permettre de récolter des cellules nucléées. Il doit également pouvoir être attribué de façon non ambiguë à l’animal à tester.

• Après vérification de l’identification de l’animal, l’analyse génétique peut être réalisée sur différents types de prélèvements :

- un échantillon de sang prélevé sur EDTA, qui retarde la dégradation enzymatique et inhibelacoagulation. Il convient, dans la mesure du possible, de remplir au moins la moitié du tube. En effet, si le volume de sang est trop faible (environ 1 ml dans un tube de 5 ml), la concentration de l’EDTA dans le prélèvement est trop importante et empêche la réaction de PCR (polymerase chain reaction), ce qui conduit à un échec de l’analyse ;

- des échantillons de cellules buccales obtenus à l’aide d’une cytobrosse ou d’un écouvillon, la cytobrosse étant plus efficace pour la collecte de cellules (PHOTO). Un échantillon de salive n’est pas adéquat car il ne contient pas suffisamment de cellules. Il convient de frotter vigoureusement l’intérieur de la joue ou de la gencive de l’animal à l’aide de la cytobrosse. Puis cette dernière est placée dans un tube contenant de l’éthanol à 70 % (éthanol non dénaturé fourni par le laboratoire) après section du manche, afin que la brosse soit immergée dans la solution et que le tube soit refermé. Tout autre liquide, sérum physiologique, éthanol dénaturé, formol, est à proscrire ;

- des poils arrachés, avec un bulbe à leur extrémité (environ une vingtaine de poils). Les poils localisés dans l’oreille de l’animal sont faciles à prélever sans douleur. Ils sont ensuite placés soit dans un tube sec, soit dans une poche plastique à fermeture zippée ;

- des biopsies : dans ce cas, il est recommandé de placer le prélèvement dans de l’éthanol à 70 % (non dénaturé).

Un élément tout aussi important que la technique de prélèvement est l’identification des tubes, enveloppes ou sachets contenant le matériel biologique. Il est en effet crucial de pouvoir attribuer sans aucun doute possible le prélèvement à l’animal à tester.

• Une fois les prélèvements réalisés et identifiés, ils sont placés dans une enveloppe à bulles puis acheminés par la poste au laboratoire à température ambiante. S’il est impossible de les envoyer dans la journée, ils peuvent être stockés au réfrigérateur pendant une semaine au maximum.

• La méthode d’obtention du profil génétique étant très spécifique d’une espèce. En d’autres termes, aucune contamination par un ADN issu d’une autre espèce que celle pour laquelle l’empreinte ADN est réalisée n’est possible.

Applications du profil génétique

• La méthode du profil génétique par PCR s’est désormais substituée à celle des “DNA fingerprints” parce qu’elle est plus facile à mettre en œuvre, moins coûteuse et qu’elle a pu être standardisée, tout en offrant une sensibilité remarquable (voir l’ENCADRÉ complémentaire “DNA fingerprints et empreinte ADN par PCR”, sur planete-vet.com). Elle est automatisée et la lecture des résultats est plus facile [8, 9].

• Différents marqueurs microsatellites, couramment appelés “panels”, sont utilisés pour réaliser l’empreinte génétique (voir l’encadré complémentaire “Marqueurs de l’ADN non codant”, sur planete-vet.com, et l’ENCADRÉ “Critères de choix des panels utilisés pour l’identification génétique”).

L’analyse d’un profil génétique permet :

- l’identification d’un individu (voir la FIGURE “Exemple de profil génétique canin”). Elle ne se substitue pas au tatouage ni à la puce électronique, mais elle est un complément de plus en plus exigé, notamment pour les importations ou les exportations. De plus, les sociétés de gestion des races se penchent sur une identification systématique des reproducteurs, en débutant par celle des reproducteurs de haut niveau. Ainsi, la déclaration de saillie est désormais gratuite si les deux géniteurs sont “identifiés ADN” par un laboratoire agréé (voir l’ENCADRÉ “Laboratoires de génétique agréés en France”). Le processus d’agrément des laboratoires pour les espèces canine et féline est actuellement en cours ;

- la vérification des liens de parenté et/ou du pedigree d’un animal. Il est parfois nécessaire d’établir une filiation par analyse ADN : paternité multiple, dans le cas d’une femelle saillie par plusieurs mâles, ou si un doute subsiste sur le géniteur [2, 3, 5]. Des prélèvements sanguins ou buccaux sont alors effectués chez les géniteurs et le ou les produits après vérification par le praticien de l’identification des animaux prélevés. Les profils génétiques obtenus sont comparés. Il convient de signaler au client que seule une analyse comportant les deux parents est acceptée par le LOF (Livre des origines françaises pour les chiens) ou le LOOF (Livre officiel des origines félines pour les chats) ;

- l’identification d’une race. Dans certaines espèces, comme chez les bovins, il est possible d’identifier la race de l’animal [1]. Jusqu’à aujourd’hui, aucun test ADN ne permet de reconnaître avec certitude une race canine ou féline [4, 6, 7, 10, 12, 15, 16] ;

- le suivi de la diversité génétique et du taux de consanguinité d’un élevage. Les empreintes ADN sont de plus en plus employées comme outils de gestion pour maintenir la diversité génétique au sein d’un cheptel. Ainsi, dans le domaine de l’aquaculture, les reproducteurs sont « identifiés ADN » et les croisements sont orientés en fonction du profil génétique des géniteurs [11, 13, 14]. Outre leurs qualités morphologiques et reproductrices, les nouveaux reproducteurs sont choisis en fonction de la diversité génétique qu’ils permettent de maintenir.

Le ministère de l’Agriculture, par l’intermédiaire d’organismes de tutelle comme la Société centrale canine, s’est fixé comme objectif l’amélioration de la gestion des races canines et félines en s’inspirant de ce qui est pratiqué dans les espèces bovine et ovine. À cette fin, l’identification génétique généralisée des reproducteurs va constituer une base de données génétiques nationale servant de référence pour contrôler les filiations des portées à venir. Concrètement, il s’agit de mettre en place une charte qualité afin de valoriser l’élevage français en combattant les fraudes, les faux pedigrees et les trafics en tout genre.

Cependant, malgré la bonne volonté de tous les acteurs de la filière, la précision et la fiabilité de l’outil génétique, l’ensemble de ce dispositif pourrait être remis en cause par une simple erreur lors du prélèvement. Le vétérinaire est amené à devenir la pierre angulaire de ce système d’identification génétique. Il va non seulement garantir la qualité du prélèvement, mais également authentifier celui-ci. Autrement dit, donner à l’outil génétique la possibilité de s’appliquer et de répondre aux attentes de l’élevage français.

Critères de choix des panels utilisés pour l’identification génétique

Le choix du panel dépend de plusieurs critères. Ce dernier doit :

- présenter un polymorphisme suffisant pour permettre d’établir une filiation fiable, même si la lignée est relativement consanguine ;

- être reconnu et standardisé au niveau international afin de mettre en place un système d’identification unique et universel ;

- permettre une reproductibilité et une répétabilité des tests.

Ainsi, l’Isag (International Society for Animal Genetics), une association qui regroupe des laboratoires publics et privés des États-Unis, du Canada, de l’Afrique du Sud, de l’Australie, de l’Allemagne, de la France, de l’Italie, des Pays-Bas et de la Belgique, des pays nordiques, etc., organise régulièrement des tests entre les laboratoires, afin de valider et de standardiser les panels employés pour l’identification génétique des animaux (canidés, félidés, ovidés, équidés et bovidés). Pour les canidés, par exemple, le panel est constitué de 22 marqueurs en raison du grand nombre de races et du taux de consanguinité parfois élevé. Pour les félidés, il comporte 19 marqueurs. En France, pour les bovidés, il rassemble neuf marqueurs internationaux et sept marqueurs français.

Laboratoires de génétique agréés en France

Les seuls critères officiels de reconnaissance pour les laboratoires de génétique sont, à l’heure actuelle, les agréments délivrés par le ministère de l’Agriculture et les accréditations ISO délivrées par le Cofrac (Comité français d’accréditation) ou d’autres organismes officiels, comme l’Afaq ou BVQI. Il n’existe qu’un seul agrément officiel pour les analyses de compatibilité génétique délivré par le ministère de l’Agriculture et il concerne les bovins. Deux normes Qualité sont applicables : l’ISO 9001 (pour l’organisation générale) et l’ISO 17025 (surtout pour la fiabilité des analyses) qui englobe une partie de l’ISO 9001.

Exemple de profil génétique canin

al = allèle. Chez le chien, comme chez le chat, entre 5 et 7 loci sont amplifiés simultanément par réaction, et se différencient par leur couleur et leur zone de migration. Quatre réactions sont nécessaires pour réaliser une empreinte génétique complète. Chaque locus présente une couleur (bleu, vert ou noir) et une zone de migration (par exemple, entre 104 et 146 pour FCA075) qui lui sont propres. Pour constituer une empreinte génétique complète, soit l’amplification de 22 loci chez le chien et de 19 chez le chat, quatre opérations doivent être effectuées sur un même prélèvement. Chacune va permettre d’amplifier simultanément entre 5 et 7 loci, comme sur l’électrophorégramme représenté dans cette figure.

Réalisation d’un prélèvement buccal chez un chat. La brosse est placée entre la gencive et la face interne de la joue de l’animal. La gueule est refermée en pressant sur la babine, de manière à bien sentir l’instrument, et une vingtaine de rotations lui sont appliquées à l’aide du manche.