Le point Vétérinaire n° 259 du 01/10/2005
 

BIOTECHNOLOGIES DE LA REPRODUCTION

Se former

EN QUESTIONS-RÉPONSES

Sylvie Chastant-Maillard*, Alain Fontbonne**, Noël Marseloo***, Christine Viaris de Lesegno****, Sandra Thoumire*****, Karine Reynaud******


*UP Reproduction, Centre
d’études en reproduction
des carnivores (Cerca)
UMR 1198 Inra/ENVA/CNRS
Biologie du développement
et reproduction
ENV d’Alfort
7, avenue du Général-de-Gaulle
94704 Maisons-Alfort Cedex
**UP Reproduction, Centre
d’études en reproduction
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Chez les bovins et chez l’homme, les techniques de reproduction assistée offrent de nombreuses possibilités. Chez le chien, en revanche, la manipulation des ovocytes et des embryons est complexe et mal maîtrisée.

Résumé

L’espèce canine est certainement la plus en retard en matière de techniques de reproduction assistée, probablement en raison de sa physiologie ovarienne particulière. L’insémination artificielle en sperme congelé représente l’état le plus avancé des biotechnologies disponibles. Le transfert embryonnaire reste une technique réservée à des laboratoires de recherche. Aucun chiot n’a encore été obtenu par production d’embryons in vitro. Deux chiots ont été obtenus par clonage en 2005. Malgré leurs intérêts potentiels (reproduction d’animaux d’élite, dépistage des tares génétiques, conservation et commercialisation du patrimoine génétique), les biotechnologies de la reproduction ne sont pas au point chez la chienne.

Chez un grand nombre d’espèces domestiques, en particulier chez les ruminants, les biotechnologies de la reproduction en sont à leur quatrième génération. Le transfert embryonnaire et la production d’embryons in vitro sont maîtrisés et le clonage a déjà été réalisé, même si les rendements sont variables selon les espèces. Chez le chien, la technique de reproduction la plus avancée est une biotechnologie de première génération : l’insémination artificielle en sperme congelé.

Plusieurs raisons peuvent expliquer ce retard de l’espèce canine. Tout d’abord, les implications économiques sont moindres, comparativement aux ruminants, ce qui explique le peu d’intérêt des chercheurs. Il peut aussi sembler paradoxal de mettre au point des techniques avancées de reproduction alors que la plupart des pays souffrent de surpopulation canine et que la reproduction naturelle globale est considérée comme suffisante, voire excédentaire. L’espèce canine présente en outre de nombreux obstacles physiologiques : le cycle est particulièrement long (environ six mois) et la physiologie de l’ovocyte est différente de celle des autres mammifères. En particulier, l’ovulation a lieu en présence d’un taux déjà élevé de progestérone car le follicule subit une lutéinisation pré-ovulatoire. L’ovulation libère en outre chez la chienne des ovocytes diploïdes, donc encore immatures et non fécondables (alors qu’ils sont directement haploïdes chez les autres mammifères) : quarante-huit à soixante heures de maturation dans l’oviducte sont nécessaires pour qu’ils deviennent haploïdes et fécondables [a].

Le matériel biologique nécessaire aux expériences est rare : chez les espèces consommées pour leur viande, l’abattoir permet de collecter de nombreux ovaires, ce qui n’est évidemment pas le cas chez la chienne (au moins en Occident).

Toutes ces difficultés concourent à ce que peu d’équipes dans le monde travaillent à la mise au point de nouvelles biotechnologies de la reproduction dans l’espèce canine. L’intérêt récemment apparu est à corréler à l’importance sociétale croissante prise par le chien, ainsi qu’à la volonté de sauvegarde de canidés en voie de disparition (lycaon, loup rouge, loup mexicain, certains renards, etc.) pour lesquels le chien domestique représente un modèle.

L’objectif de cet article est de faire le point sur l’état actuel de développement des techniques de procréation assistée chez la chienne : la transplantation d’embryons produits in vivo, in vitro, les micromanipulations telles que la fécondation assistée (ICSI) et le clonage.

Qu’est-ce que la transplantation d’embryons produits in vivo ?

La production d’embryons in vivo consiste à collecter les embryons par lavage de l’appareil génital d’une femelle en général superovulée et inséminée (la fécondation a donc lieu in vivo). Les embryons obtenus (PHOTO 1) sont ensuite transférés chez des femelles receveuses dont le cycle a été préalablement synchronisé avec celui de la donneuse.

Comparés à ceux des autres mammifères, les embryons canins passent un temps particulièrement long dans l’oviducte [11] : huit à neuf jours (pour une gestation de 63 jours) contre, par exemple, quatre jours chez la vache (pour une gestation de 280 jours). Chez la chienne, plusieurs difficultés se présentent pour la mise au point de cette technique par ailleurs couramment employée chez les ruminants et chez l’homme :

- la chienne ne répond pas ou mal aux traitements hormonaux de superovulation classiquement utilisés (FSH ou eCG). Il est donc difficile d’augmenter le nombre de descendants par femelle ;

- le rendement des collectes effectuées par rinçage de l’utérus ou des oviductes est faible : 30 à 40 % des embryons formés sont récupérés. Cela semble dû à l’hypertrophie marquée de la muqueuse utérine lors des chaleurs chez la chienne : les embryons se trouvent alors piégés dans des replis de celle-ci. Les rendements augmentent nettement lors d’exérèse des trompes ou de l’utérus, mais ces techniques ont peu d’intérêt en pratique. À l’inverse, 90 % des embryons collectés sont viables [11, 12] ;

- le recrutement des receveuses est problématique car les protocoles hormonaux de synchronisation des cycles ne sont pas maîtrisés chez la chienne. Un effectif important de femelles serait nécessaire pour en obtenir plusieurs qui ovulent en même temps que la donneuse, ce qui reste aléatoire. Il semble qu’un décalage supérieur à deux jours ne permette pas la gestation [13].

Chez la chienne, le transfert d’embryons en est encore à un stade expérimental. Le peu d’essais réalisés ont porté sur un nombre restreint de femelles (au mieux une dizaine) selon des modalités variées (stade de l’embryon, transfert dans l’oviducte ou dans l’utérus, etc.). L’étude la plus porteuse d’espoirs est celle de Tsutsui et coll. [13] : le transfert d’embryons collectés du stade huit cellules au stade blastocyste (huit à onze jours après l’ovulation) dans l’utérus de 21 femelles receveuses a permis un taux de gestation de 57 %. Environ la moitié des embryons transférés chez les femelles gestantes ont donné naissance à des chiots.

La mise au point de la transplantation d’embryons produits in vivo permettrait d’augmenter le nombre de descendants par femelle (si une femelle ne réalise pas elle-même sa gestation, elle peut “produire” à tous les cycles via des receveuses, alors qu’il n’est pas recommandé qu’une chienne soit gestante tous les six mois) et de faire reproduire des femelles incapables de mener à bien une gestation. Si les embryons canins s’avèrent congelables (comme c’est le cas dans beaucoup d’espèces), la technique autorisera les échanges et la conservation de matériel génétique. Elle rendrait aussi possible le diagnostic de tares génétiques (diagnostic pré-implantatoire ou DPI): après biopsie de quelques cellules embryonnaires chez les embryons collectés, des techniques de biologie moléculaire permettraient de rechercher les gènes responsables de l’apparition de tares. Seuls les embryons indemnes de la tare recherchée seraient ensuite transférés. Cette technique existe pour l’embryon humain. Chez le chien, les gènes responsables de plusieurs tares sont connus et recherchés chez l’adulte [b], ils pourraient donc l’être chez l’embryon.

Comment produire des embryons in vitro ?

À la différence du protocole précédent, la fécondation est effectuée in vitro, au laboratoire.

1. Collecte des ovocytes

La première étape consiste à collecter des ovocytes avant l’ovulation, donc directement au sein de l’ovaire. Cela n’est faisable qu’après une ovariectomie et ne présente donc un intérêt qu’immédiatement après la mort d’une chienne, ou éventuellement avant un traitement stérilisant (chimio- ou radiothérapie) afin d’obtenir une portée supplémentaire. Cette solution ne peut être retenue pour les chiennes saines qui doivent rester des reproductrices à long terme.

Chez les bovins, il est possible de collecter des ovocytes directement dans l’ovaire par ponction folliculaire sous contrôle échographique ou, moins couramment, endoscopique (Ovum Pick-Up ou OPU). Les vaches peuvent être ainsi prélevées pendant plusieurs mois sans conséquence pour leur fertilité ultérieure.

Chez la chienne, cette technique n’a jamais été décrite. Des considérations anatomiques et physiologiques rendent sa réalisation plus difficile que chez les grands animaux :

- la taille des follicules (au maximum 7 mm de diamètre contre 2 cm chez la vache, PHOTO 2) ;

- la présence de follicules ponctionnables pendant environ une semaine seulement sur toute la durée d’un cycle (six mois), sans possibilité hormonale d’augmenter le nombre de follicules (superovulation) ;

- la difficulté de réaliser une échographie ovarienne.

La collecte d’ovocytes pourrait également être envisagée sous cœlioscopie. Néanmoins, la bourse adipeuse qui entoure l’ovaire gêne sa mise en œuvre et le nombre de follicules ponctionnables par cycle ne peut être augmenté. Cette option endoscopique, qui est décrite chez la chatte, n’a pas été testée chez la chienne.

2. Maturation ovocytaire in vitro

Les ovocytes prélevés dans l’ovaire ne peuvent être fécondés directement. Ils sont en effet diploïdes (2N chromosomes, PHOTO 3). Leur passage au stade haploïde (N chromosomes) après la méiose est nécessaire avant de les mettre en présence de spermatozoïdes. Cette phase dite de “maturation in vitro” est facilement obtenue chez les mammifères autres que la chienne (et la renarde). Chez les bovins, par exemple, 90 % des ovocytes sont passés au stade haploïde après vingt-quatre heures dans un milieu supplémenté (œstradiol, FSH, LH). Chez la chienne, après soixante-douze à quatre-vingt-seize heures de culture et quel que soit le cocktail hormonal utilisé, seulement 5 à 10 % des ovocytes ont fini leur maturation. La plupart (60 %) ne l’ont même pas entamée [5, 8, 9].

Cette inefficacité de la maturation in vitro chez la chienne est probablement à mettre en rapport avec une particularité physiologique de cette espèce. Lors de l’ovulation chez les mammifères “classiques”, l’ovocyte reprend immédiatement sa méiose. Chez la chienne, l’ovocyte ne reprend sa méiose que quarante-huit heures après l’ovulation [a, 11]. Les facteurs responsables de ce retard spécifique de la chienne ne sont pas connus, mais ils participent probablement au mauvais rendement de la maturation ovocytaire dans cette espèce. En outre, environ 25 % des ovocytes canins mis en culture dégénèrent.

3. Fécondation in vitro

La fécondation in vitro est obtenue en ajoutant les spermatozoïdes au milieu de culture qui contient les ovocytes maturés. Alors que les taux de fécondation atteints chez les bovins sont de l’ordre de 80 à 90 %, ils sont très faibles chez la chienne, entre 10 et 20 %. Un fort taux de polyspermie est en outre constaté : plus d’un spermatozoïde pénètre l’ovocyte, ce qui est incompatible avec le développement embryonnaire [9].

4. Développement embryonnaire

Une fois la fécondation obtenue, les embryons sont rincés, puis cultivés sous atmosphère contrôlée. Les embryons qui se développent normalement après quelques jours de culture (six à huit jours chez les bovins, deux à six jours chez l’homme) sont ensuite transférés dans l’utérus de femelles receveuses. Le cycle de celles-ci doit être synchrone avec l’âge de l’embryon transféré.

Trente pour cent d’embryons correctement développés (stade blastocyste) sont couramment obtenus chez la vache de J6 à J8 et leur transfert donne lieu à 50 % de naissances. Chez la chienne, la réalisation de telles manipulations reste du domaine de la recherche et aucune des étapes n’est au point. Ainsi, Otoi et coll. [6] ont obtenu un blastocyste (J9) à partir de 217 ovocytes en maturation. Après la mise en maturation de 169 ovocytes, leur fécondation in vitro puis le transfert de 90 embryons chez une seule receveuse, England et coll. [1] ont obtenu une gestation de trois conceptus, qui sont morts vers vingt et un jours.

La production d’embryons in vitro aurait pourtant plusieurs intérêts en reproduction canine :

- l’augmentation du nombre de descendants par femelle génétiquement intéressante. L’expérience chez les bovins montre qu’elle est alors supérieure à la hausse obtenue avec le transfert d’embryons produits in vivo ;

- la reproduction d’animaux infertiles en saillie ou en insémination ;

- la recherche de tares génétiques (diagnostic pré-implantatoire).

Quelles sont les techniques de fécondation assistée ?

La technique d’ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection) pourrait être utilisée afin de permettre la reproduction de chiens oligo-asthénospermiques ou pour augmenter les taux de fécondation obtenus in vitro. Cette méthode est couramment employée chez l’homme pour traiter l’infertilité (en alternative à la fécondation in vitro simple). Il s’agit d’injecter un spermatozoïde directement dans l’ovocyte avec une micropipette sous contrôle microscopique. L’embryon ainsi obtenu est cultivé in vitro, puis transféré chez une femelle receveuse.

Dans l’espèce canine, cette technique n’a été décrite qu’une seule fois [2]. Pourtant réalisée avec du sperme de bonne qualité, elle n’a permis d’obtenir la formation d’embryons au stade une cellule que pour 8 % des ovocytes micro-injectés. La suite de leur développement n’a pas été observée.

Qu’attendre du clonage du chien ?

1. Résultats du clonage canin

Le clonage fait actuellement appel à la technique de transfert nucléaire (voir l’ENCADRÉ et la figure “Clonage : la technique de transfert nucléaire”) à partir de cellules somatiques prélevées chez un individu adulte. Des naissances ont ainsi déjà été obtenues chez plusieurs espèces (bovin, porc, chèvre, souris, lapin, rat, mule, cheval, chat), à la suite de la brebis Dolly. Les rendements sont faibles, puisqu’en moyenne 100 à 400 embryons doivent être reconstitués pour obtenir la naissance d’un individu.

Dans l’espèce féline, le premier chaton cloné est né en décembre 2001 (Copycat) et plus d’une dizaine de naissances (Felis catus) ont déjà été rapportées [10, 16, site de la société américaine, Genetic Savingsand Clone ou GSC : www.savingsandclone.com]. En 2003, des chats sauvages d’Afrique (Felis silvestris libica) sont également nés par clonage au zoo Audubon (Nouvelle-Orléans, États-Unis) et viennent de se reproduire [3].

Dans l’espèce canine, un grand projet a été lancé en 1998 pour mettre au point le clonage (projet Missyplicity de la société GSC). Les résultats obtenus par cette équipe commerciale n’ont pas été divulgués, hormis le rendement du clonage qui reste extrêmement faible [14, 15].

La société GSC annonçait pouvoir obtenir une naissance de chiot cloné en 2005. Cependant, l’équipe du Pr Hwang (Corée du Sud) a été la première à faire naître deux chiots vivants issus du transfert de cellules cutanées de l’oreille [4]. Pour obtenir ces animaux, plus de mille trois cents ovocytes ont été nécessaires, qui ont permis le transfert de 1095 embryons clonés dans 123 chiennes receveuses. Un chiot est mort à l’âge de vingt-deux jours et le chiot survivant, Snuppy (un mâle lévrier afghan), a été présenté publiquement en août dernier, à l’âge de trois mois. Cet animal reste, pour le moment, une exception. En effet, le rendement de la technique de clonage utilisée, qui a mobilisé une équipe de quinze personnes pendant deux ans, est très faible (0,2 %).

2. Intérêts potentiels

Le clonage de cellules adultes pourrait avoir plusieurs applications dans l’espèce canine. La principale est la sauvegarde de génotypes intéressants. Le clonage permettrait alors de créer une réplique d’un animal afin que ses caractéristiques génétiques ne disparaissent pas avec lui. Cela pourrait s’appliquer aux canidés appartenant à des espèces en voie de disparition, aux champions de beauté ou de travail, ou aux chiens de particuliers lorsque les propriétaires y sont très attachés.

Le clonage pourrait également permettre de générer des lots de chiens génétiquement identiques, qui représenteraient des outils puissants pour la recherche biomédicale (modèles de maladies humaines).

Néanmoins, quelle que soit l’application, il est illusoire aujourd’hui d’espérer obtenir des clones de chiens en grand nombre, compte tenu de la faiblesse du rendement et de la logistique que cela nécessite.

3. Limites du clonage

Actuellement, la technique n’est donc pas au point dans l’espèce canine et il reste de nombreuses difficultés à surmonter. Certaines d’entre elles sont liées à l’espèce elle-même (faibles taux de maturation ovocytaire in vitro, synchronisation des cycles pour disposer de femelles receveuses en grand nombre), mais d’autres sont intrinsèques à la technique de clonage de cellules adultes. Les connaissances acquises chez la souris et chez les bovins montrent que le chiot ou le chaton issus de clonage ne sont pas obligatoirement des copies phénotypiques de l’animal donneur : robes, distribution des taches, comportement et performances différents. Cette variation est susceptible de décevoir le particulier qui souhaite obtenir une copie conforme de son animal. Le clonage somatique fait en outre apparaître chez environ 30 % des fœtus et nouveau-nés bovins des anomalies graves, qui conduisent le plus souvent à l’avortement, à la mort du clone dans les premières semaines de vie, voire à la mort de la femelle receveuse. Les anomalies observées sont principalement des hyperdéveloppements du placenta, une croissance excessive du fœtus, des anomalies cardiaques et immunitaires, des troubles de la croissance de certains organes [7]. Les mécanismes responsables restent à ce jour inconnus.

Outre ces anomalies du développement embryonnaire et fœtal, le clonage des carnivores domestiques pose des questions éthiques particulières en raison de l’importance “sociétale” de ces animaux. Ces animaux de compagnie occupent une place particulière au sein de la famille, ce qui explique que leurs clones doivent être considérés différemment que ceux des souris ou des vaches. Le clonage des chiens et des chats, en particulier tel qu’il est présenté par la société GSC, apparaît donc comme un moyen de “résurrection” d’un animal mort, ce qui n’est pas sans soulever de nombreuses questions.

L’espèce canine présente des difficultés particulières en matière de biotechnologies de la reproduction. Des études fondamentales sont nécessaires pour comprendre la régulation de la reproduction de la chienne, différente à de nombreux titres de celle que partagent les autres espèces de mammifères. Jusqu’à récemment, d’aucuns ont cru pouvoir calquer sur la chienne les techniques mises au point chez la vache. La chienne se révèle désormais une “exception physiologique” en matière de reproduction. Certains craignent que ces biotechnologies ne conduisent à la perpétuation de lignes infertiles ou à la réduction de la biodiversité, mais cela supposerait un développement que ces techniques sont encore loin d’approcher chez les carnivores.

Clonage : la technique de transfert nucléaire

La première étape consiste à extraire le matériel génétique nucléaire d’ovocytes maturés in vitro, haploïdes (stade métaphase II). Les ovocytes fournissent ainsi des cytoplasmes dits “receveurs”. Parallèlement, les cellules donneuses (qui fourniront l’information génétique) sont préparées : par exemple, quelques millimètres carrés de peau prélevés par simple biopsie sont mis en culture, pour obtenir quelques dizaines de milliers de cellules, génétiquement identiques.

Une de ces cellules donneuses est placée au contact du cytoplasme receveur ovocytaire. Un choc électrique permet ensuite de faire fusionner ces deux éléments. La cellule étant transférée dans sa totalité, il s’agit plutôt de transfert cellulaire. Une solution alternative à cette technique existe, qui consiste à ne transférer que le noyau : il s’agit alors de transfert de chromatine.

Dans un certain (faible) pourcentage des cas, l’embryon ainsi reconstitué reprend son développement et peut être transféré dans l’utérus d’une femelle receveuse. En répétant cette reconstitution un grand nombre de fois, un nombre infini d’animaux génétiquement identiques peut, en théorie, être obtenu.

Congrès

a - Fontbonne A, Reynaud K, Marseloo N et coll. In vivo meiotic resumption, fertilization and early embryonic development in the bitch. Proc. 5th International Symposium on Canine and Feline Reproduction. Sao Paulo, Brésil. 4-6 août 2004;144-146.

b - Queney G. La détection des maladies génétiques grâce aux outils de biologie moléculaire. Dans : L’éleveur et l’élevage canin : aujourd’hui et demain. Proc. Société française de cynotechnie, Nantes, 12-13 décembre 2003;197-202.

Points forts

Les particularités physiologiques de la reproduction chez la chienne sont responsables du retard des biotechnologies de la reproduction canine.

La chienne ne répond pas aux traitements de superovulation et de synchronisation, ce qui rend difficiles les protocoles de transplantation embryonnaire avec les embryons produits aussi bien in vivo qu’in vitro.

Les taux de fécondation atteints in vitro sont très faibles chez la chienne, entre 10 et 20 %. Chez les bovins, ils sont de l’ordre de 80 à 90 %.

La mise au point de la transplantation d’embryons produits in vivo rendrait possible le diagnostic pré-implantatoire de tares génétiques. Seuls les embryons indemnes de la tare recherchée seraient ensuite transférés.

Le clonage canin est possible, mais il est aujourd’hui exceptionnel. Son rendement est très faible (de l’ordre de 0,2 %) et seulement deux individus (dont un seul vivant à deux mois) ont été obtenus à l’heure actuelle.

  • 1 - England GCW, Verstegen JP, Hewitt DA. Pregnancy following in vitro fertilisation of canine oocytes. Vet. Rec. 2001;148:20-22.
  • 2 - Fulton RM, Keskintepe L, Durrant BS et coll. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) for the treatment of canine infertility. Theriogenology. 1998;48:366.
  • 3 - Gomez MC, Pope CE, Giraldo A et coll. Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats. Cloning Stem Cells. 2004;6:247-258.
  • 4 - Lee BC, Kim MK, Jang G et coll. Dogs cloned from adult somatic cells. Nature. 2005;4:641.
  • 5 - Luvoni G, Chigioni S, Allievi E et coll. Factors involved in vivo and in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology. 2005;63:41-59.
  • 6 - Otoi T, Murakami M, Fujii M et coll. Development of canine oocytes matured and fertilised in vitro. Vet. Rec. 2000;146:52-53.
  • 7 - Renard JP, Chavatte-Palmer P. Le clonage de l’animal et son apport en recherche vétérinaire. Bull. Acad. Vét. France. 2004;157:5-15.
  • 8 - Reynaud K, Saint-Dizier M, Chastant-Maillard S. In vitro maturation and fertilization of canine oocytes. In : H. Schatten (eds.). Methods Mol. Biol. Germ cell protocols 53. Humana Press, Totowa. 2004;255-272.
  • 9 - Saint-Dizier M, Renard JP, Chastant-Maillard S. Induction of final maturation by sperm penetration in canine oocytes. Reproduction. 2001;121:97-105.
  • 10 - Shin T, Kraemer DC, Pryor J et coll. A cat cloned by nuclear transplantation. Nature. 2002;415:859.
  • 11 - Tsutsui T. Gamete physiology and timing of ovulation and fertilization in dogs. J. Reprod. Fertil. Suppl. 1989;39:269-275.
  • 12 - Tsutsui T, Shimada K, Nishi M et coll. An experimental trial on embryo transfer in the dog. Jpn. J. Vet. Sci. 1989;51:797-800.
  • 13 - Tsutsui T, Hori T, Okazaki H et coll. Transfer of canine embryos at various developmental stages recovered by hysterectomy or surgical uterine flushing. J. Vet. Med. Sci. 2001;63:401-405.
  • 14 - Westhusin ME, Burghardt RC, Rugila JN et coll. Potential for cloning dogs. J. Reprod. Fert. Suppl. 2001;57:287-293.
  • 15 - Westhusin M, Hinrichs K, Choi YH et coll. Cloning companion animals (horses, cats and dogs). Cloning and Stem Cells. 2003;5:301-317.
  • 16 - Yin XJ, Lee HS, Lee YH et coll. Cats cloned from fœtal and adult somatic cells by nuclear transfer. Reproduction. 2005;129:245-249.

PHOTO 1. Les embryons canins (ici au stade six cellules) possèdent un cytoplasme sombre, dû à une grande richesse en gouttelettes lipidiques.

Clonage : la technique de transfert nucléaire

Les rendements de cette technique sont faibles, puisqu’en moyenne 100 à 400 embryons sont nécessaires pour obtenir la naissance d’un individu.

PHOTO 2. Chez la chienne, les follicules ovariens atteignent un diamètre de 7 à 8 mm avant l’ovulation.

PHOTO 3. L’ovulation libère chez la chienne un ovocyte diploïde (ici en microscopie confocale, l’ADN étant marqué en rouge, la tubuline en vert) entouré de couches denses de cellules de la granulosa.