Le point Vétérinaire n° 258 du 01/09/2005
 

DÉPISTAGE DE COXIELLA BURNETII PAR PCR

Éclairer

NOUVEAUTÉS

Raphaël Guatteo*, François Beaudeau**, Véronique Descarsin***, Éric Sellal****, Annie Rodolakis*****, Alain Joly******, Henri Seegers*******


*UMR ENVN–INRA
Gestion de la Santé Animale,
BP 40706,
44307 Nantes Cedex 03
**UMR ENVN–INRA
Gestion de la Santé Animale,
BP 40706,
44307 Nantes Cedex 03
***AES laboratoire,
Rue Maryse Bastié,
Ker Lann, CS 17219,
35172 Bruz Cedex
****Union Bretonne des
Groupements de Défense
Sanitaire, GDS 56, BP 110,
6 avenue Edgar Degas,
56000 Vannes
*****UR INRA Pathologie
Infectieuse et Immunologie,
INRA Tours, 37380 Nouzilly
******Union Bretonne des
Groupements de Défense
Sanitaire, GDS 56, BP 110,
6 avenue Edgar Degas,
56000 Vannes
*******UMR ENVN–INRA
Gestion de la Santé Animale,
BP 40706,
44307 Nantes Cedex 03
********Laboratoire Service
International,
1 bis allée de la Combe,
69380 Lissieu

La détection de C. burnetii par PCR, évaluée sur le terrain, montre la possibilité d’excrétion fécale et implique de diversifier les prélèvements.

La détection des bovins excréteurs de Coxiella burnetii est un point critique pour l’évaluation des risques de transmission de l’infection par Coxiella burnetii entre bovins et des bovins à l’Homme. Coxiella burnetii peut être excrétée dans les produits de la parturition (mucus vaginal, lochies) [3], les fèces [1, 2], le sperme [6], l’urine [5] ainsi que le lait [3, 7, 8].

La technique PCR (Polymerase chain reaction) est une méthode de choix pour mettre en évidence l’excrétion bactérienne. Les techniques Elisa disponibles présentent en effet des défauts de sensibilité et l’examen bactérioscopique par coloration de Stamp-Machiavello, utilisé en routine pour la détection de Coxiella burnetii dans le placenta des vaches qui ont avorté, présente de faibles valeurs de sensibilité et spécificité [4]. L’isolement bactérien ne peut être envisagé à grande échelle (il nécessite un laboratoire de haut niveau de protection).

Une PCR dite “en temps réel” a été développée récemment. Elle permet la quantification et l’automatisation des tâches (voir l’ENCADRÉ “La PCR “temps réel” : une technique moins fastidieuse et quantitative”). Le seul frein majeur à son utilisation reste le coût de l’équipement. Ses performances sur plusieurs types de prélèvements (mucus vaginal, fèces, lait) ont été caractérisées pour la première fois à grande échelle en conditions réelles dans les troupeaux bovins laitiers.

242 vaches de 31 troupeaux

Deux cent quarante-deux vaches laitières de trente et un troupeaux ont été soumises à prélèvements.

Lestroupeaux éligibles devaient présenter les caractéristiques suivantes :

Coxiella burnetii a été mise en évidence directement (coloration de Stamp) ou indirectement (sérologie) ;

- la prévalence intra-troupeau des animaux porteurs d’anticorps est supérieure ou égale à 30 % (sur un échantillon de dix bovins prélevés dans le cadre des protocoles classiques d’avortements) et l’analyse sérologique date de moins de six mois, et/ou un animal a une coloration de Stamp positive datant de moins de trois mois. Au sein de ces troupeaux, les bovins éligibles sont les animaux séropositifs et/ou Stamp positifs, et qui ont mis bas moins de quarante-cinq jours avant la visite (l’excrétion bactérienne est alors maximale d’après A. Rodolakis, communication personnelle).

PCR sur lait, fèces et mucus

Surchaquebovinsont prélevés :

- du lait issu des quatre quartiers, en respectant les règles d’asepsie. L’échantillon est réfrigéré et acheminé dans un délai inférieur à quarante-huit heures ;

- des matières fécales (avec un gant de fouille stérile) ;

- dumucusvaginal (par écouvillonnage après le nettoyage de la zone périnéale). La présence de Coxiella burnetii est recherchée à l’aide de deux techniques PCR “temps réel” : le kit Adiavet Cox Real Time® (Adiagène, Saint-Brieuc, France) et le Kit LSI Taqvet Coxiella burnetii (Laboratoire Service International, Lissieu, France).

Excrétion par les trois voies

Afin d’améliorer les valeurs prédictives d’excrétion et de non-excrétion du test, seuls les résultats concordants entre les deux kits PCR ont été retenus. Au total, plus de 80 % des prélèvements de lait, de fèces et de mucus vaginal présentent un résultat concordant entre les deux kits PCR utilisés (voir la FIGURE “Distribution des valeurs de Ct obtenus pour les prélèvements de lait, de mucus vaginal et de fèces”). Coxiella burnetii a été détectée dans 13,2 % des prélèvements de mucus vaginal, dans 11,8 % des prélèvements de fèces, et dans 13 % des prélèvements de lait. Ces fréquences correspondent toutefois à un échantillon particulier, constitué pour maximiser la probabilité de prélever des vaches excrétrices. Elles ne sont donc pas généralisables. Aucune voie d’excrétion ne semble prédominante (voir le TABLEAU “Distribution des voies d’excrétion de ). Une seule voie d’excrétion est détectée chez la plupart des bovins. Lorsqu’un même bovin excrète concomitamment par deux voies, il s’agit le plus souvent de la combinaison mucus vaginal-fèces. Les animaux détectés excréteurs simultanément par les trois voies sont rares.

Ainsi, latechniquePCR semble performante pour la mise en évidence de Coxiella burnetii chez les bovins laitiers dans les trois types de prélèvements étudiés. Cette étude a permis la première détection en conditions d’élevage de C. burnetii dans les fèces de bovins laitiers. La voie fécale est donc à prendre en compte pour la maîtrise des risques de transmission de l’infection entre bovins et des bovins à l’Homme, par exemple via l’inhalation d’aérosols contaminés en provenance de la litière souillée. Coxiella burnetii a été détectée chez des vaches ayant avorté ou infertiles, comme chez des vaches cliniquement saines. Dans la mesure où aucune voie d’excrétion ne prédomine, il convient de pratiquer des recherches non pas sur un, mais sur les trois supports (lait, fèces et mucus vaginal) pour identifier les bovins excréteurs, sources de contamination des animaux sensibles.

Cette étude soulève aussi de nombreuses questions sur la cinétique de l’excrétion, notamment sur la chronologie des trois voies d’excrétion identifiées. Une autre étude “fièvre Q” a débuté en mars 2005, qui a pour but de décrire les caractéristiques de l’excrétion de Coxiella burnetii chez les bovins laitiers (durée, intensité, caractère éventuellement intermittent). Elle est menée conjointement par l’unité de recherche UMR ENVN-INRA Gestion de la Santé Animale et l’Union bretonne des groupements de défense sanitaire (UBGDS).

La possibilité de quantifier la charge bactérienne des échantillons offerte par les techniques PCR “temps réel” ouvre des perspectives, pour l’évaluation des risques de transmission de Coxiella burnetii entre animaux et à l’Homme et des mesures de maîtrise médicales (vaccination et antibiothérapie) de cette infection.

Dans deux prochains articles, une démarche pratique de prélèvement lors de fièvre Q qui découle de ces travaux sur les voies d’excrétion sera présentée, ainsi qu’une revue de la littérature illustrant les lacunes qui restent à combler sur cette zoonose.

La PCR “temps réel” : une technique moins fastidieuse et quantitative

Dans la PCR “classique”, les séquences d’ADN cibles sont amplifiées exponentiellement et sélectivement. Les produits sont séparés en fonction de leur poids moléculaire sur le gel d’agarose et visualisés sous ultraviolets. Ces différentes étapes nécessitent de nombreuses précautions en particulier lors de la manipulation des amplicons (risque de contaminations).

Dans la PCR “temps réel”, les amplicons sont visualisés dès leur accumulation dans le tube où se déroule la réaction PCR, à l’aide d’un fluorimètre couplé à un thermocycleur et grâce à la connaissance du lien entre la fluorescence émise et la quantité de molécules. La sonde retenue est par exemple couplée à un fluorophore et à un absorbeur de fluorescence (un “quencher”, qui transforme cette fluorescence en chaleur lorsque la sonde recherchée ne s’interpose pas). Ainsi, lorsque la sonde s’hybride spécifiquement à sa séquence complémentaire, une fluorescence est émise. Cette étape entraîne une augmentation de la fluorescence au sein du mélange réactionnel, dont la mesure, au terme de chaque cycle d’extension, permet de suivre l’évolution de la réaction au cours du temps.

Le cycle à partir duquel la courbe de fluorescence croise la droite correspondant au seuil de détection représente le Cycle threshold (Ct, threshold = seuil). Un Ct précoce correspond à une augmentation de fluorescence forte et rapide, c’est-à-dire à une quantité élevée d’ADN cible. Par convention, un Ct égal au nombre total de cycles réalisés est caractéristique d’une réaction négative (la fluorescence ne dépasse jamais la droite-seuil). Au sein d’une même série, les différents échantillons peuvent être classés par quantité d’ADN croissante. Un échantillon positif avec un Ct à 25 contient plus d’ADN cible (de l’agent pathogène recherché) qu’un échantillon avec un Ct à 35.

  • 1 - Arricau-Bouvery N, Souriau A, Moutoussamy A et coll. Étude de l’excrétion de Coxiella burnetii dans un modèle expérimental caprin et décontamination des lisiers par la cyanamide calcique. Renc. Rech. Ruminants. 2001 ; 8 : 153-156.
  • 2 - Berri M, Laroucau K, Rodolakis A. The detection of Coxiella burnetii from ovine genital swabs, milk and fecal samples by the use of a single touchdown polymerase chain reaction. Vet. Microbiol. 2000 ; 72 : 285-293.
  • 3 - Berri M, Souriau A, Crosby M et coll. Shedding of Coxiella burnetii in ewes in two pregnancies following an episode of Coxiella abortion in a sheep flock. Vet. Microbiol. 2002 ; 85 : 55-60.
  • 4 - Fournier PE, Marrie TJ, Raoult D. Diagnosis of Q fever. J. Clin. Microbiol. 1998 ; 36 : 1823-1824.
  • 5 - Heinzen RA, Hackstadt T, Samuel JE. Developmental biology of Coxiella burnetii. Trends Microbiol. 1999 ; 7 : 49-154.
  • 6 - Kruszewska D, Tylewska-Wierzbanowska S. Isolation of Coxiella burnetii from bull semen. Res. Vet. Sci. 1997 ; 62 : 299-300.
  • 7 - Willems H, Thiele D, Frölich-Ritter R et coll. Detection of Coxiella burnetii in cow’s milk using the polymerase chain reaction (PCR). J. Vet. Med. B. 1994 ; 41 : 580-587.
  • 8 - Woernle H, Limouzin C, Muler K et coll. La fièvre Q bovine - effets de la vaccination et de l’antibiothérapie sur l’évolution clinique et l’excrétion de Coxiella dans le lait et les sécrétions utérines. Bull. Acad. Vet. 1985 ; 58 : 91-100.

Distribution des valeurs de Ct obtenus pour les prélèvements de lait, de mucus vaginal et de fèces

Les tests sont baptisés A et B pour des raisons de confidentialité. Lorsque Coxiella burnetii a été détectée par les deux kits, les Ct obtenus sont similaires. Au total, 200 prélèvements de lait, 204 prélèvements de fèces et 205 prélèvements de mucus vaginal présentaient un résultat concordant entre les deux kits PCR utilisés (> 80 %).

Distribution des voies d’excrétion de Coxiellla burnetii détectées à l’aide des deux techniques PCR “temps réel”

+ : détection de l’ADN de Coxiella burnetii dans le prélèvement considéré à l’aide des deux kits PCR.- : non détection de l’ADN de Coxiella burnetii dans le prélèvement considéré à l’aide des deux kits PCR.La plupart des bovins n’ont excrété que par une seule voie. Moins de 7 % des vaches excrétrices excrètent par les trois voies, soit moins de 2 % de l’ensemble des vaches prélevées.