Le point Vétérinaire n° 255 du 01/05/2005
 

EXAMENS COMPLÉMENTAIRES LORS DE MAMMITES CHEZ LA VACHE

Pratiquer

EN IMAGES

Ellen Schmitt-van de Leemput*, Annie Schmitt-Beurrier**


*Clinique vétérinaire, 53700 Villaines-La-Juhel
**Laboratoire d’analyses médicales, 53700 Villaines-La-Juhel

Un praticien rural peut réaliser lui-même les analyses bactériologiques de prélèvements de lait avec des techniques de bactériologie classiques.

Le terme “mammites” regroupe les infections cliniques ou subcliniques de la mamelle, principalement d’origine bactérienne. Même si l’expression clinique desmammitesest peu différente selon les bactéries incriminées, la pathogénie, la pathophysiologie et l’approche thérapeutiquediffèrent considérablement selon les germes [1]. Identifier le germe en cause est donc fondamental avant de prescrire un traitement. Les symptômes et les données épidémiologiques peuventpermettre une suspicion, mais l’examen bactériologique du lait de mammite est la seule méthode fiable pour identifier le germe [2, 3].

Méthode “à la clinique”

De nombreuses méthodes bactériologiques sont disponibles pour identifier les agents pathogènes mammaires. Cet article décrit l’une d’elles, peu onéreuseetadaptéeau praticien généraliste qui exerce en élevage laitier. Les gestessont simples et prennent peu de temps.

En utilisant des milieux de culture sélectifs, les germes sont identifiés grâce à leurs caractéristiques biochimiques et morphologiques. Les cinq agents pathogènes mammaires majeurs peuvent ainsi être identifiés de façon fiable : Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Str. dysgalactiae et Str. agalactiae. L’identification est effectuée en trois étapes, qu’il convient impérativement de respecter dans l’ordre.

Coût et durée

La dépense initiale à engager pourunlaboratoirede bactériologie en clientèle varie entre 300 et 500 €, selon l’incubateur choisi. Pour chaque analyse, le prix du matériel varie entre 2 (Escherichia coli) et 5 € (Streptococcus spp).

La “mise en culture” initiale prend environ cinq minutes. Pour effectuer la distinction entre les bactéries Gram - et Gram +, douze à vingt-quatre heuresde culture sont nécessaires, sansautre manipulationgrâce aux milieux sélectifs. Parmi les Gram +, la différenciation entrestaphylocoques et streptocoques est effectuée grâce à un seul test simple (catalase), qui prend environ trente secondes. Avec trente secondes de plus, Staphylococcus aureus est identifié (coagulase +). Pour distinguer entre les trois différents sous-types de streptocoques, deux étapes supplémentaires sont nécessaires, qui nécessitent une incubation de quinze minutes à deux heures.

Cette méthode entrois grandes étapes permet une identification simple et fiable des cinq agents pathogènes mammairesprincipaux. Toutefois, si les bactéries ne correspondent pas aux critères indiqués, l’implication d’une autre bactérie doit être envisagée et la culture doit être envoyée à un laboratoire spécialisé.

Congrès

a - Blain S. Intérêt et technique de l’identification bactérienne des germes de mammite au cabinet du vétérinaire. In : Thérapeutique, actualités, outils de prescription. SNGTV Tours. 2004:811-822.

b - Poutrel B. Le diagnostic bactériologique des mammites pour et par le vétérinaire praticien ; intérêt et limites. In : De la recherche à la clinique. Société Française de Buiatrie, Maillard R. Ed. Paris. 2003:172-181.

c - Sears PM. Using milk culture diagnosis for mastitis treatment decisions. In : De la recherche à la clinique. Société Française de Buiatrie, Ed. Paris 2003:162-171.

d - Van de Leemput E, Schmitt- Beurrier A, Fréret H et coll. Analyse bactériologique de prélèvements de lait dans le cadre d’une clientèle rurale : approche bactériologique et résultats. Proc. Journée Nantaise Bovine. 2002:129.

  • 1 - Blowey RW, Weaver AD.A colour atlas of diseases and disorders of cattle. Wolfe Publishing Ltd. London England. 1991:178-179.
  • 2 - Morin DE, Constable PD, McCoy GC. Use of clinical parameters for differentiation of gram-positive and gram- negative mastitis in dairy cows vaccinated against lipopolysaccharide core antigens. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998 ; 1 ; 212(9):1423-1431.
  • 3 - Schmitt-van de Leemput E, Salat O. Antibiothérapie raisonnée lors de mammites aiguës. Point Vét. 2005;36(252):34-36.

Ensemencement Trois différentes géloses sont ensemencées, en suivant la procédure du schéma ci-dessus, à l’aide d’une öse plastique calibrée (pipette à l’extrémité arrondie calibrée pour 10 µl). Elles sont mises à incuber à 37 °C. La première, non sélective ausang“GS” (5 % sang de mouton), sert à vérifier la pureté de l’échantillon. Les deux autres servent à l’identification : l’une au sang contient de l’acide nalidixique et de la colistine (“ANC” : sélective, inhibe la pousse des germes Gram-), l’autre du bromocrésol (“BCP”).

Vérification de la qualité de l’échantillon (GS) La plupart des mam­mites sont dues à un seul type de bactérie : un seul type morpho­logique de colonie doit donc être observésurla gélose non sélective GS (mono­culture). Dans le cas contraire, l’échantillon de lait est déclaré contaminé et l’identification ne peut être poursuivie.

Première étape : distinction entre Gram- et Gram+ Dès qu’une croissance suffisante est observée (douze à vingt-quatre heures), les géloses ANC et BCP sont examinées. Sur l’ANC, seules les bactéries Gram + croissent. Sur la BCP, tous les Gram- et certains Gram + croissent.

Première étape : distinction entre Gram- et Gram+ Dès qu’une croissance suffisante est observée (douze à vingt-quatre heures), les géloses ANC et BCP sont examinées. Sur l’ANC, seules les bactéries Gram + croissent. Sur la BCP, tous les Gram- et certains Gram+ croissent.

Première étape : identification finale des bactéries Gram- Les Gram- qui utilisent le lactose comme substrat de croissance, comme Escherichia coli et Klebsiella, font virer la gélose BCP du pourpre au jaune. Les colonies d’Escherichia coli sont petites (A), celles de Klebsiella ont un aspect plus “gras” et large (B).

Première étape : identification finale des bactéries Gram- Les Gram- qui utilisent le lactose comme substrat de croissance, comme Escherichia coli et Klebsiella, font virer la gélose BCP du pourpre au jaune. Les colonies d’Escherichia coli sont petites (A), celles de Klebsiella ont un aspect plus “gras” et large (B).

Deuxième étape : distinction entre staphyloccoque et streptocoque par le catalase test Une goutte d’eau oxygénée est déposée sur une lame de verre porte-objets. Une colonie est prélevée à l’aide d’une öse et déposée dans l’eau oxygénée. Une effervescence traduit la dégradation de l’eau oxygénée en dioxygène : le germe, alors dit “catalase +”, est un staphylocoque (B). S’il n’y a pas effervescence, le germe, dit “catalase -”, est un streptocoque (A).

Troisième étape : identification définitive de Staphylococcus aureus par le coagulase test Sur une lame de verre porte-objets, une ou deux colonies sont disperséesdansunegoutte de suspension d’hématies sensibilisées (Slidex Staph plus, Biomerieux), en donnant à la lame un léger mouvement de rotation. Une agglutination massive apparaissant en quinze secondes (coagulase+) indique que le Staphylococcus testé appartient à l’espèce aureus (1). Sinon, il s’agit de Staphy­lococcus coagulase - (2) qui n’est pas systématiquement pathogène.

Troisième étape : identification des Streptococcus selon un premier critère : l'hémolyse Le type d’hémolyse est observé sur la gélose ANC initialement mise en culture : - Α hémolyse : halo diffus, vert (A, Streptococcus uberis ou dysgalactiae) ; - β hémolyse : halo clair, net autour de la colonie (B, Streptococcus agalactiae) ; - absence d’ hémolyse (C, Streptococcus uberis ou dysgalactiae). Ce critère ne permet pas à lui seul de distinguer entre dysgalactiae et uberis : certains hémolysent, d’autres non, cette remarque étant valable pour les deux espèces.

Troisième étape : identification des Streptococcus selon un premier critère : l'hémolyse Le type d’hémolyse est observé sur la gélose ANC initialement mise en culture : - Α hémolyse : halo diffus, vert (A, Streptococcus uberis ou dysgalactiae) ; - β hémolyse : halo clair, net autour de la colonie (B, Streptococcus agalactiae) ; - absence d’ hémolyse (C, Streptococcus uberis ou dysgalactiae). Ce critère ne permet pas à lui seul de distinguer entre dysgalactiae et uberis : certains hémolysent, d’autres non, cette remarque étant valable pour les deux espèces.

Troisième étape : identification des Streptococcus selon un premier critère : l'hémolyse Le type d’hémolyse est observé sur la gélose ANC initialement mise en culture : - Α hémolyse : halo diffus, vert (A, Streptococcus uberis ou dysgalactiae) ; - β hémolyse : halo clair, net autour de la colonie (B, Streptococcus agalactiae) ; - absence d’ hémolyse (C, Streptococcus uberis ou dysgalactiae). Ce critère ne permet pas à lui seul de distinguer entre dysgalactiae et uberis : certains hémolysent, d’autres non, cette remarque étant valable pour les deux espèces.

Troisième étape : identification des Streptococcus selon un second critère : le test à l’esculine Certaines bactéries peuvent hydrolyser l’esculine (Esculine +), comme Streptococcus uberis, contrairement à Str. agalactiae et dysgalactiae. Des colonies sont injectées au centre de la gélose à l’esculine (en tube). L’échantillon est mis à incuber à 37 °C. Les composés libérés au cours de l’hémolyse, lorsqu’elle se produit, réagissent avec les sels de fer pour donner une coloration noire à un milieu gélose initialement beige, en trente minutes à deux heures.

Troisième étape : identification des Streptococcus selon un troisième critère : agglutination de Lancefield (Lf) Sur la base de leurs antigènes de surface, les Streptococcus agalactiae (Lf, groupe B) et dysgalactiae (Lf, groupe C) peuvent être distingués (Streptococcus uberis est non groupable par ce critère). Deux ou trois colonies sont incubées pendant quinze minutes dans une solution d’extraction pour libérer des antigènes. Des gouttes de cette solution sont ensuite mélangées avec les différentes solutions d’anticorps (Slidex streptokit, Biomérieux). Un résultat positif correspond à l’apparition en moins de deux minutes d’une agglutination franche (sur la PHOTO : agglutination groupe B, Streptococcus agalactiae).