Le point Vétérinaire n° 243 du 01/03/2004
 

PATHOLOGIE DE LA REPRODUCTION

Se former

COURS

Abdessalem Rekiki*, Annie Rodolakis**


*INRA, Pathologie infectieuse
et immunologie,
Centre de Tours-Nouzilly,
37380 Nouzilly
**Institut national de la recherche
vétérinaire de Tunis, 12 rue Djebel
Larka, La Rabta, Tunis (Tunisie)
***INRA, Pathologie infectieuse
et immunologie,
Centre de Tours-Nouzilly,
37380 Nouzilly

Le diagnostic des avortements infectieux des petits ruminants repose essentiellement, en routine, sur des techniques de laboratoire classiques, qui reconnaissent certaines limites.

Résumé

Les éléments épidémiologiques et cliniques sont insuffisants pour établir le diagnostic étiologique des avortements infectieux chez les petits ruminants. De nombreuses techniques de laboratoire peuvent être utilisées, l’intérêt et les limites de chacune d’elles variant selon le contexte et la nature de l’agent pathogène incriminé. Parmi les techniques directes, l’isolement suivi de l’identification est une méthode de choix pour le diagnostic de la salmonellose, de la campylobactériose, de la brucellose, de la listériose et de la Border Disease. La bactérioscopie, plus rapide, peut aussi être utilisée, mais elle manque souvent de sensibilité et de spécificité. Les principales méthodes de diagnostic indirect sont la fixation du complément (intérêt surtout pour la toxoplasmose), la sérologie Elisa (toxoplasmose, chlamydiose et fièvre Q), l’immunofluorescence (toxoplasmose) et l’agglutination (salmonellose). L’essor de la PCR devrait augmenter significativement les possibilités de diagnostic dans les années à venir.

La détection précoce des agents responsables des d’avortements infectieux chez les petits ruminants est indispensable pour mettre en place rapidement des mesures prophylactiques et sanitaires efficaces. Les signes cliniques et le taux d’incidence ne peuvent pas être valablement utilisés pour établir un diagnostic, qui doit obligatoirement être confirmé par des examens de laboratoire. De nombreuses techniques sont alors utilisées, pour mettre en évidence l’étiologie infectieuse, soit directement (examen microscopique, isolement, mise en évidence des antigènes), soit indirectement (sérologie). Cependant, elles ne permettent d’identifier généralement que la moitié des causes d’avortements chez les ovins et les caprins [21].

La précocité de la détection dépend dans une large mesure de la qualité des prélèvements, des techniques de diagnostic employées et de la coordination des efforts entre l’éleveur, le vétérinaire et le laboratoire de diagnostic. Néanmoins, l’identification rapide de la cause d’un avortement n’est pas chose aisée.

Compte tenu de la possibilité non négligeable d’infections mixtes dans un élevage, le diagnostic des avortements des petits ruminants doit être obligatoirement un diagnostic différentiel [40]. Le nombre et le type d’examens réalisés dépendent de la situation épidémiologique locale. En fonction des moyens du laboratoire d’analyse et de critères économiques et sanitaires, les recherches sont parfois limitées d’abord aux principales maladies abortives bactériennes, les autres n’étant envisagées que par la suite.

Diagnostic épidémiologique et clinique

1. Période de gestation

La période de la gestation à laquelle survient l’avortement ne peut valablement orienter le diagnostic. Si au cours des infections à Brucella melitensis [18], à Chlamydophila abortus [36], à Salmonella Abortusovis [34], à Coxiella burnetii [24], à Leptospira [11] ou à Toxoplasmosa gondii [5], les avortements sont observés principalement pendant le dernier tiers de la gestation, des avortements précoces peuvent néanmoins se produire également (PHOTO 1). Listeria monocytogenes [19] peut provoquer des avortements au cours de la première moitié de gestation et Campylobacter fœtus [35] pendant le deuxième tiers. Dans ce dernier cas, quelques avortements sont fréquemment observés au troisième ou au quatrième mois de gestation, puis une flambée d’avortements deux à trois semaines plus tard. Cependant, l’augmentation de la fréquence des avortements pendant la période hivernale, saison d’ouverture des silos, peut faire penser à la listériose ou à une infestation par des champignons et des levures.

2. Signes cliniques et lésions

L’infection peut également se traduire par des atteintes inflammatoires localisées (voir le TABLEAU “Symptômes et lésions macroscopiques pouvant être observés lors d’avortements chez les petits ruminants”) au niveau :

- du tractus génital, occasionnant des métrites à Chlamydophila abortus [36], à Campylobacter fœtus, à Listeria monocytogenes [19], à Coxiella burnetii [24] ou à Salmonella Abortusovis [34] ;

- du système respiratoire, entraînant des pneumonies à Chlamydophila abortus ou Coxiella burnetti [24] ;

- du système digestif : Salmonella ou Listeria monocytogenes (diarrhées) ;

- du système nerveux : Listeria monocytogenes (Circling Disease), Toxoplasma gondii [5] ;

- des glandes mammaires : leptospires, Chlamydophila abortus ou Coxiella burnetii, Brucella, Mycoplasma (PHOTO 2).

Toutefois, la naissance d’agneaux chétifs présentant des retards de croissance, incapables de se tenir debout, ou des anomalies du squelette, de la toison et du système nerveux (agneaux poilus ou trembleurs) est symptomatique de la Border Disease [30] (PHOTO 3). L’expulsion de fœtus momifiés et d’agneaux miniatures brun-chocolat souvent accompagnés de petits placentas est associée à la toxoplasmose.

Un diagnostic clinique à partir de l’avorton et du placenta est généralement difficile (voir le TABLEAU “Symptômes et lésions macroscopiques pouvant être observés lors d’avortements chez les petits ruminants”). En effet, l’avorton peut être autolysé, et le placenta ne présentera des lésions typiques qu’en cas d’atteintes par des champignons ou des toxoplasmes (foyers nécrotiques blancs caractéristiques). À l’autopsie du fœtus, des foyers de nécrose sur le foie de 0,5 à 2 cm de diamètre avec une forme caractéristique de beignet, le centre étant déprimé et la périphérie surélevée, peuvent faire penser à la campylobactériose.

Diagnostic direct

1. Isolement

L’isolement est la seule technique qui permette vraiment un diagnostic de certitude. En effet, lorsque Robert Koch a établi pour la première fois en 1876 [22] une relation entre un agent pathogène particulier et une maladie en démontrant l’origine bactérienne de l’anthrax, il a défini les critères à remplir pour établir la relation de causalité entre un agent spécifique et une maladie. Ces critères, connus sous le nom de postulats de Koch (voir le TABLEAU “Postulats de Koch”), stipulent l’isolement du micro-organisme comme une condition nécessaire pour établir un diagnostic.

Le principe de l’isolement est de permettre aux germes de se multiplier dans des milieux de cultures. L’identification et la caractérisation des germes, deuxième étape, peuvent faire appel aux propriétés biochimiques et antigéniques. Elles peuvent également s’adresser à des caractères particuliers, comme la mise en évidence de facteurs de virulence ou l’étude de la sensibilité aux antibiotiques ou aux phages.

Prélèvements à réaliser

L’écouvillon vaginal est le meilleur prélèvement pour l’isolement des agents responsables d’avortements infectieux. En effet, il peut être prélevé proprement en évitant les contaminations extérieures qui souillent fréquemment les cotylédons lorsque les placentas sont ramassés dans la litière. Si le fœtus est disponible, le contenu stomacal ou le cerveau (en particulier pour l’isolement des salmonelles, des Listeria, des toxoplasmes, des Brucella et du virus de la Border Disease) sont de très bons prélèvements dans la mesure où ils constituent pratiquement une culture pure. Le lait constitue également un bon prélèvement, notamment pour la brucellose et la fièvre Q.

Limites de l’isolement

Cependant, l’isolement n’est pas toujours réalisable dans un diagnostic de routine. Le délai nécessaire pour l’isolement et l’identification de certains agents abortifs infectieux à croissance lente est souvent important, allant de 48 à 72 heures pour les Chlamydophila et jusqu’à plusieurs semaines (huit à vingt) pour Leptospira. D’autre part, l’isolement de Chlamydophila abortus, de Coxiella burnetii, de Toxoplasma gondii ou des pestivirus n’est possible que sur cultures cellulaires, sur œufs embryonnés ou sur souris, techniques peu compatibles avec un diagnostic de routine [37]. En effet, leur multiplication intracellulaire exige des prélèvements réalisés sous des conditions rigoureuses d’asepsie et de propreté, ce qui est souvent difficile à obtenir dans les conditions de terrain. En outre, la réussite de l’isolement dépend du nombre d’agents infectieux abortifs viables dans les prélèvements. Or le nombre de germes excrétés décroît souvent rapidement après l’avortement ou sous l’action d’un éventuel traitement aux antibiotiques et, dans la majorité des cas, l’excrétion devient intermittente au bout de quelques jours à une semaine.

Les conditions d’acheminement vers le laboratoire peuvent également altérer la survie des micro-organismes. En effet, les Chlamydophila [37, 43], les Campylobacter [29], les leptospires et les pestivirus sont fragiles et survivent difficilement dans le milieu extérieur. Ils doivent être acheminés rapidement au laboratoire dans les milieux de transports adéquats.

De plus, la culture des Coxiella, des Brucella ou des toxoplasmes est dangereuse pour le manipulateur et exige un laboratoire confiné de niveau 3.

Enfin, il est difficile d’incriminer de nouveaux agents abortifs dont les conditions de culture sont encore ignorées. En effet, il est estimé que seules 1 % des bactéries présentes sur terre ont été cultivées [16] et que, parmi les 36 groupes de bactéries actuellement décrits, 13 sont composés entièrement de bactéries non cultivables [20].

Utilisations pratiques

• Salmonellose

L’isolement reste la technique de choix du diagnostic de la salmonellose. Les salmonelles sont isolées, sans enrichissement préalable, préférentiellement à partir d’au moins deux organes de l’avorton (contenu stomacal et cerveau) ou d’un écouvillon vaginal. En cas d’avortement, les bactéries sont suffisamment nombreuses pour permettre l’isolement direct. Elles ne nécessitent pas de milieu spécifique, cependant, l’utilisation de tels milieux permet d’associer la culture et l’identification des Salmonella ainsi que d’éviter des contaminations par les Proteus ou des bactéries Gram+. Le plus utilisé est le milieu SS (Salmonella-Shigella) [33]. À 37 °C sur ce milieu, les salmonelles ubiquistes forment en moins de 24 heures des colonies blanches avec un centre noir, ce qui indique qu’elles ne dégradent pas le lactose mais qu’elles produisent de l’H2S. Salmonella Abortusovis forme des colonies plus petites qui peuvent être facilement confondues avec des contaminants. Elles ont souvent tendance à donner des colonies de tailles différentes sur la même boîte. Les colonies sont ensuite repiquées pour être caractérisées par leurs propriétés biochimiques.

• Campylobactériose

L’isolement est également la meilleure technique de diagnostic de la campylobactériose, malgré la fragilité de la bactérie et les difficultés de la culture, qui est généralement réalisée sur gélose Columbia ou Brucella enrichie de 5 % de sang de mouton ou de cheval [9]. Il peut être nécessaire de filtrer le prélèvement (broyat de placenta, contenu gastrique ou broyat du foie fœtal) sur un filtre de 0,65 µm pour éliminer les contaminants. Après 48 à 72 heures d’incubation sur gélose au sang, à 37 °C sous une atmosphère microaérophile (5 % O2, 10 % CO2 et 85 % N2 ou H2), les colonies apparaissent petites, rondes, convexes et granuleuses pour le groupe de C. fœtus, et, pour C. jejuni et C. coli, comme de grosses colonies muqueuses ayant tendance à l’essaimage et à la dissociation, c’est-à-dire à donner sur la même boîte un mélange de grosses et de petites colonies qui peuvent apparaître bronzées lorsqu’elles vieillissent. Lorsque les cultures vieillissent, elles peuvent donner, à l’exception de C. fœtus, des formes coccoïdes non viables, qui peuvent apparaître au bout de 48 heures de culture pour C. jejuni. L’identification des Campylobacter se fait par la suite par une coloration de Gram, une réaction d’oxydase et une réaction de catalase pour distinguer entre les espèces catalase positive et catalase négative.

• Brucellose

Bien qu’il ne soit pas toujours réalisé en routine, l’isolement est également recommandé pour le diagnostic de la brucellose et devrait remplacer le plus souvent possible la bactérioscopie [46]. Il est peu sensible et assez difficile à réaliser. Il s’effectue en utilisant des milieux spécifiques, à partir de plusieurs prélèvements, de préférence l’écouvillon vaginal et le lait. Sinon, tous les prélèvements du fœtus, le sang et l’urine peuvent être utilisés pour ensemencer du milieu de Farrell. Les colonies sont visibles après deux à trois jours d’incubation. La caractérisation du genre Brucella repose sur l’observation de la morphologie des bactéries directement et après coloration de Gram, de la morphologie des colonies (PHOTO 4) et de leurs caractéristiques de croissance, ainsi que des réactions d’oxydase et de catalase et de l’agglutination par un sérum anti-Brucella. La caractérisation de l’espèce relève du laboratoire spécialisé. Elle s’effectue classiquement par l’étude de la sensibilité aux phages et du profil de métabolisme oxydatif et, maintenant, par une caractérisation par PCR.

• Listériose

L’isolement de Listeria monocytogenes est effectué en homogénéisant le prélèvement (écouvillon vaginal ou contenu stomacal, cerveau, poumon, foie du fœtus) dans de l’eau peptonée, puis en l’incubant pendant 24 heures à 37 °C dans un bouillon cœur-cervelle suivi de trois jours à 37° C sur une gélose PALCAM (polymyxine, acriflavine, LiCl, céfrazidine, esculine, mannitol) [26]. Les colonies sont ensuite repiquées sur des géloses au sang de mouton où elles apparaissent après une nuit de culture comme de petites colonies lisses, rondes, de 1 à 2 mm de diamètre, translucides et légèrement bombées avec un bord régulier. L. monocytogenes, L. ivanovii et L. seeligeri sont hémolytiques et sont donc entourés d’une zone d’hémolyse. L’espèce de Listeria est ensuite caractérisée par la coloration de Gram, la mobilité à température ambiante et la réaction de catalase.

• Border Disease

En cas de suspicion de Border Disease, l’isolement du pestivirus est réalisé à partir du sang hépariné de la mère ou du placenta et des organes du fœtus sur cultures primaires ou secondaires de rein, testicule ou poumon d’agneau ou, plus facilement, sur des lignées de cellules ovines non contaminées.

• Autres maladies

L’isolement de leptospires n’est pas adapté au diagnostic de routine, il est du ressort des laboratoires spécialisés car leur culture est difficile, longue et coûteuse. Cependant, l’isolement est la technique la plus sensible. Il s’effectue sur milieu semi-solide (0,1 % d’agar) tel que le milieu d’EMJH (Ellinghausen-McMullough-Johnson-Harris) additionné de sérum frais de lapin. Il est nécessaire d’ensemencer au moins six tubes de culture par échantillon et de les cultiver pendant au moins douze semaines à 29 °C. Les cultures sont observées au microscope à fond noir chaque semaine.

De même l’isolement de Chlamydophila abortus sur cellules Mc Coy ou Hela, de Coxiella burnetii sur cellules Vero ou par passage sur souris, puis culture sur œuf embryonné ou culture de cellules, de Toxoplasma gondii sur souris ou sur culture de cellules n’est pas utilisé lors d’un diagnostic de routine.

2. Bactérioscopie

À défaut de pouvoir isoler les agents abortifs, leur détection peut se faire par des examens microscopiques directs ou après coloration d’un frottis ou d’un calque de cotylédons. Diverses colorations sont alors utilisées.

La coloration de Stamp, ou ses variantes Machiavello et Ziehl-Neelsen, reste toujours la technique la plus utilisée pour le diagnostic de la brucellose, de la chlamydiose et de la fièvre Q, même si elle est peu sensible et peu spécifique et s’il est souvent difficile de distinguer Chlamydophila abortus, Brucella abortus, Brucella melitensis ou Coxiella burnetii [18, 36]. Elle est en effet rapide et à la portée de tous les laboratoires. Elle demande cependant un personnel exercé pour éviter de trop nombreuses confusions et doit obligatoirement être associée à un examen sérologique.

Utilisations de la bactérioscopie

Campylobacter et les leptospires peuvent être identifiés par un examen direct de prélèvements au microscope à fond noir, lorsque ces bactéries ont conservé leur mobilité caractéristique en vol de moucheron pour Campylobacter ou par rotation, flexion et translation de fins spirochètes aux extrémités recourbées pour les leptospires. Néanmoins, cet examen nécessite un observateur entraîné. En outre, il ne permet pas de différencier les leptospires pathogènes des saprophytes, ni les Leptospira des genres Leptonema. Les résultats sont également tributaires de la richesse du prélèvement en agent pathogène. La détection de bactéries sur un frottis, par exemple, nécessite la présence d’au moins 105 bactéries/ml dans l’échantillon initial. Les Campylobacter peuvent également être mises en évidence par coloration de Gram ou mieux de Ziehl-Neelsen. La coloration de Gram permet également la mise en évidence des Listeria, alors que la coloration de Giemsa est utilisée pour rechercher les kystes tissulaires formés par Toxoplasma gondii qui apparaissent comme des structures circulaires de 5 à 50 µm remplies de bradyzoïtes en forme de croissant, colorées en bleu.

Intérêts et limites de la bactérioscopie

Le défaut majeur de ces techniques est leur manque de sensibilité et de spécificité. Elles ont en revanche l’avantage d’être rapides et de pouvoir être exécutées dans de nombreux laboratoires. L’utilisation de techniques de détection antigéniques a pu améliorer la spécificité et la sensibilité du diagnostic. Les agents abortifs sont révélés par des anticorps spécifiques (mono- ou polyclonaux) couplés à l’isothiocyanate de fluorescéine (immunofluorescence) ou à la phosphatase alcaline (Elisa). Chlamydophila abortus [47], Coxiella burnetii [15], Campylobacter sp. [45], Brucella melitensis [18], Listeria monocytogenes [27], Leptospira sp. [12], Toxoplasma gondii [44] et le virus de la Border Disease [13] ont pu être ainsi identifiés. La technique peut être conduite plus rapidement que l’isolement. Néanmoins, son utilisation est limitée par le coût des anticorps marqués et par la présence de réactions croisées pouvant donner des faux positifs dus à l’utilisation d’anticorps dirigés contre des antigènes de genre communs entre, d’une part, plusieurs sérovars, comme dans le cas des Campylobacter [45], des Listeria et des leptospires [28], et, d’autre part, plusieurs espèces, comme dans le cas de la chlamydiose abortive qui peut donner des réactions croisées avec C. pecorum [36].

Des faux négatifs peuvent être également observés, dus soit à un manque de sensibilité de la technique, par exemple pour détecter les agneaux virémiques âgés de moins de deux mois au cours du diagnostic de la Border Disease [30], ou aux changements de structure de l’antigène cible.

La sensibilité de la technique dépend par conséquent de la spécificité des anticorps utilisés.

Ainsi, aussi bien la bactérioscopie que la mise en évidence des antigènes constituent seulement un diagnostic de présomption qui permettra d’orienter les investigations, mais qui doit obligatoirement être confirmé par une analyse sérologique.

3. Immunohistologie

Les toxoplasmes peuvent également être mis en évidence sur des coupes de tissus, par histologie ou, mieux, en utilisant des techniques d’immunomarquage à la peroxydase qui détectent leurs antigènes ou les résidus antigéniques du parasite intra- ou extracellulaire, y compris dans les tissus nécrosés.

Diagnostic indirect

Lorsqu’il n’a pas été possible de mettre en évidence l’agent pathogène responsable de l’avortement, il convient de rechercher la preuve de son intervention par la présence d’anticorps spécifiques. Pour établir une association entre une réponse sérologique et un agent infectieux, Alfred Evans (1976) a proposé un certain nombre de critères à satisfaire (voir le TABLEAU “Postulats d’Evans”). Dans le cas des avortements infectieux, il n’est pas toujours possible de répondre à ces exigences, tout particulièrement aux deux premières. Par exemple, pratiquement tous les ruminants sains hébergent Chlamydophila pecorum dans leur tractus digestif [17], ce qui induit une réponse anticorps qui croise avec Chlamydophila abortus, si bien qu’avant le déclenchement de la maladie et l’exposition à Chlamydophila abortus les animaux sont déjà sérologiquement positifs et il n’est pratiquement jamais détecté d’IgM dans le sérum des brebis qui avortent. Un portage peut également s’observer avec Campylobacter, auquel s’ajoutent de nombreuses réactions croisées et des réponses anticorps faibles, ce qui limite l’intérêt de la sérologie dans le cas de la campylobactériose. De la même façon, le diagnostic sérologique de la listériose manque de sensibilité et de spécificité. Par ailleurs, compte tenu de la persistance d’un titre sérologique élevé pendant longtemps après une primo-infection à Toxoplasma gondii, Listeria monocytogenes, Coxiella burnetii ou Chlamydophila abortus, une sérologie positive ne peut établir qu’un diagnostic de présomption. Elle permet uniquement de refléter le contact de l’animal avec l’agent abortif, sans dire si l’infection est encore active ou non et sans distinguer une infection latente d’un épisode abortif.

Le diagnostic sérologique est donc un diagnostic de troupeau et ne peut en aucun cas être utilisé pour distinguer les animaux infectés des animaux encore indemnes au sein du troupeau. Il doit être un diagnostic différentiel et, pour prouver le caractère enzootique de l’avortement, l’échantillon doit comporter au minimum une dizaine de prélèvements de sang effectués chez des bêtes ayant avorté. Si ce nombre n’est pas atteint au moment de l’intervention, il peut être complété par des prélèvements réalisés chez des femelles n’ayant pas avorté à condition que les commémoratifs précisent le statut des animaux [41].

Le choix de la technique dépend de la nature de l’agent abortif (voir le TABLEAU “Caractéristiques des techniques sérologiques utilisées pour le diagnostic des avortements”). Néanmoins, l’étude des diverses classes d’anticorps n’est facilement réalisable qu’avec des techniques Elisa ou d’immunofluorescence.

1. Fixation du complément

Le test de fixation du complément (FC) a été très largement utilisé bien qu’il s’agisse d’une technique assez complexe, qui demande une grande rigueur dans la préparation et la standardisation des réactifs. Il reste encore la méthode de référence préconisée par l’Office international des épizooties [31] pour le diagnostic de la chlamydiose, de la fièvre Q et de la brucellose.

Pour la brucellose, la FC doit être associée à l’EAT (épreuve à l’antigène tamponné ou test du “rose Bengale”) (PHOTO 5), car si l’EAT est une technique simple, rapide et bon marché, elle donne des faux négatifs qui peuvent être détectés par fixation du complément. En effet, les résultats de ces deux tests ne sont pas synchrones [3]. Ils doivent être simultanément pris en considération pour augmenter le nombre d’animaux infectés détectés [3].

Pour la chlamydiose, l’antigène utilisé est un antigène de groupe (LPS), qui détecte également les anticorps dirigés contre Chlamydophila pecorum, ce qui a amené à fixer un seuil (1/80) à partir duquel les animaux sont considérés comme positifs [37].

La FC ne devrait pas être utilisée pour le diagnostic de la fièvre Q chez les petits ruminants car elle manque de sensibilité et peut difficilement être reliée à l’avortement, les anticorps ne persistant souvent que très peu de temps après l’avortement, alors que d’autres animaux peuvent rester longtemps positifs sans avorter. Il convient cependant de n’utiliser en aucun cas les mêmes seuils que pour la chlamydiose.

La FC est classiquement utilisée pour le diagnostic de la toxoplasmose et a tendance à remplacer le Dye Test de Sabin et Friedman considéré comme le test décisif, mais qui est long, cher et dangereux car il nécessite des tachyzoïtes vivants.

La FC peut également être utilisée pour rechercher des anticorps anti-Campylobacter ou anti-Listeria, mais cela ne présente que peu d’intérêt pour le diagnostic de ces infections.

D’autre part, la FC ne permet pas de rechercher la présence d’IgM. Le diagnostic ne pourra être établi que si une séroconversion est constatée au cours de prélèvements successifs postérieurs de trois semaines ou un mois à l’avortement ou la mise bas (excepté pour la fièvre Q), ou à défaut par l’analyse d’une dizaine de sérums d’animaux ayant avorté à différents délais avant le prélèvement, ce qui permet une interprétation du niveau d’infection dans le troupeau [40].

2. Elisa

L’Elisa (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (PHOTO 6) tend de plus en plus à remplacer la FC pour le diagnostic de la toxoplasmose, de la chlamydiose et de la fièvre Q. Cette technique peut pratiquement être utilisée pour toutes les infections abortives, à l’exception de la salmonellose, pour laquelle elle est beaucoup trop sensible et trop peu spécifique, et de la campylobactériose où le diagnostic sérologique n’a pas d’intérêt réel.

L’Elisa est en effet rapide, simple, et l’interprétation des données n’est pas ambiguë car elle supprime le problème des sérums anticomplémentaires. Elle permet de tester un grand nombre de prélèvements car elle est facilement automatisable. Elle est plus sensible que la FC, particulièrement pour la détection de Coxiella burnetii [23].

C’est actuellement la technique sérologique la mieux adaptée au diagnostic de la fièvre Q, même si de nombreux animaux restent séropositifs pendant plusieurs années sans avorter ni excréter de Coxiella [1] et si quelques-uns peuvent excréter des Coxiella par voie vaginale pendant plusieurs mois en étant séronégatifs [1].

Pour la chlamydiose, elle présente de nombreux avantages [10]. Cependant, puisqu’elle utilise le même type d’antigène, elle présente les mêmes inconvénients que la FC en matière de spécificité. Toutefois, un kit Elisa utilisant un antigène recombinant spécifique de Chlamydophila abortus porté par une famille de protéines d’environ 90 kDa [42] permet d’établir un diagnostic très précoce, dès huit jours après l’infection expérimentale [8], et spécifique [4] (voir la FIGURE “Réponse en Elisa-r de brebis inoculées avec C. abortus (S26/3) ou C. pecorum (iB1)”).

L’Elisa est également utilisable pour la brucellose. Elle est plus sensible et plus précoce que la FC, mais moins spécifique. En revanche, elle donne de très bons résultats lorsqu’elle est réalisée sur le lait, où elle est à la fois sensible et spécifique. Des kits utilisant des antigènes recombinants spécifiques de Brucella melitensis [6] ou de Brucella abortus [39] ont donné des résultats satisfaisants, cependant, ils ne sont pas encore standardisés.

Pour la listériose, l’Elisa détectant des anticorps anti-listériolysine O, un facteur de virulence majeur de Listeria monocytogenes, donne des résultats intéressants.

Pour la leptospirose, l’Elisa est une technique sensible et spécifique malgré des réactions croisées et des faux négatifs avec certains sérovars. Elle est moins dangereuse à réaliser que la microagglutination (MAT), qui est le test de référence et qui consiste à agglutiner des leptospires vivants.

De nombreux kits Elisa sont également disponibles et validés pour le diagnostic de la Border Disease. Ils donnent de très bons résultats. Ceux qui détectent des anticorps protecteurs sont mieux corrélés avec la séroneutralisation, qui met en évidence les anticorps dirigés contre les glycoprotéines d’enveloppe.

3. Immunofluorescence

L’immunofluorescence (IF) est généralement aussi sensible que l’Elisa, mais elle exige un examen au microscope qui n’est pas automatisable. Elle est surtout utilisée pour la toxoplasmose. Des kits d’immunofluorescence indirecte (Fluorescente Antibody Test ou IFAT) sont disponibles. Ils donnent des titres équivalents au Dye Test mais sont d’utilisation plus commode, puisqu’ils utilisent un antigène tué. Largement utilisée en médecine humaine pour la fièvre Q, où elle est le test sérologique de référence, l’immunofluorescence l’est beaucoup moins en médecine vétérinaire et il n’existe pas de kit commercial pour le diagnostic des avortements à Coxiella burnetii chez les petits ruminants.

4. Agglutination

L’agglutination lente des anticorps anti- antigène H, plus spécifiques que les agglutinines anti-O, est le test sérologique de référence pour le diagnostic de la salmonellose à Salmonella Abortusovis. Cette technique simple (elle consiste à mettre en présence un antigène coloré inactivé et des dilutions croissantes de sérums), rapide et peu coûteuse donne de bons résultats dans les semaines qui suivent l’avortement [33].

Pour la brucellose enfin, les techniques d’immunodiffusion en gélose (IDG) ou d’hypersensibilité retardée peuvent également être utilisées. L’IDG est moins sensible que l’EAT, mais plus spécifique. En ce qui concerne l’hypersensibilité retardée, très utilisée pour la brucellose porcine, elle l’est beaucoup moins chez les ovins.

L’avènement de la PCR

Depuis l’avènement de la PCR (Polymerase Chain Reaction ou amplification génique), l’apport de la biologie moléculaire est constant dans l’amélioration du diagnostic des causes infectieuses. Son utilisation a permis de multiplier par plus de 40 le nombre de bactéries identifiées [32]. De plus l’utilisation de techniques de PCR à large spectre permet d’identifier de nouveaux micro-organismes auxquels on ne penserait pas a priori, ou même des micro-organismes inconnus.

Bien que la détermination de la cause d’un avortement infectieux à partir d’un fragment d’acide nucléique permette une identification rapide et spécifique (voir le TABLEAU “Critères de Fredricks et Relman”) tout en évitant de recourir à des méthodes “classiques” souvent handicapées par leur manque de sensibilité et/ou de spécificité, l’utilisation de la PCR n’est pas encore généralisée dans les laboratoires vétérinaires. Cette technique nécessite en effet un matériel et des réactifs onéreux, du personnel spécialisé et des locaux réservés pour éviter l’obtention de résultats faussement positifs ou faussement négatifs. Le perfectionnement de la technique par des kits d’extraction de l’ADN, l’incorporation de témoins internes et le développement de la PCR multiplex diagnostiquant en une seule opération plusieurs micro-organismes abortifs, en particulier ceux dont l’isolement n’est pas facile, devraient pallier tous ces inconvénients (PHOTO 7). Différents couples d’amorces ont en effet été décrits pour toutes les causes d’avortements infectieux et la PCR est, par exemple, la technique de choix pour la mise en évidence de Coxiella burnetii, tout particulièrement dans le lait [1].

ATTENTION

• L’écouvillon vaginal est le meilleur prélèvement pour l’isolement des agents responsables d’avortements infectieux.

• Si le fœtus est disponible, le contenu stomacal ou le cerveau sont aussi de très bons prélèvements pour l’isolement.

ATTENTION

Dans certaines circonstances, Campylobacter et les leptospires peuvent être identifiés par un examen direct de prélèvements au microscope à fond noir.

ATTENTION

L’isolement est la technique la plus sensible pour la mise en évidence des leptospires, mais il n’est pas adapté au diagnostic de routine.

ATTENTION

La détection de bactéries sur un frottis nécessite la présence d’au moins 105 bactéries/ml dans l’échantillon initial.

ATTENTION

Le diagnostic sérologique est un diagnostic de troupeau et ne peut être utilisé pour distinguer les animaux infectés des animaux indemnes au sein du troupeau.

ATTENTION

La prévalence des sérologies positives vis-à-vis de Chlamydophila pecorum limite l’intérêt du diagnostic sérologique de la chlamydiose abortive.

Points forts

Les techniques classiques de laboratoire ne permettent d’identifier généralement que la moitié des causes d’avortements chez les ovins et les caprins.

La période de la gestation à laquelle survient l’avortement ne peut valablement orienter le diagnostic de la plupart des infections abortives.

Un diagnostic clinique à partir de l’avorton et du placenta est généralement difficile à établir.

L’isolement est la technique de choix du diagnostic de la salmonellose abortive et de la campylobactériose.

Les techniques bactérioscopiques sont rapides et ne peuvent être exécutées dans de nombreux laboratoires, mais elles sont peu sensibles et peu spécifiques.

Dans la plupart des cas, une sérologie positive ne peut établir qu’un diagnostic de présomption. Elle permet uniquement de refléter le contact de l’animal avec l’agent abortif, sans dire si l’infection est encore active ou non et sans distinguer une infection latente d’un épisode abortif.

En savoir plus

- Autef P. Dominantes pathologiques du péripartum. Point Vét. 2002 ; 33(n° spécial “Pathologie ovine et caprine”) : 8-11.

- Bout D, Buzoni-Gatel D, Chardes T, Reperant JM, Cotty F, Calamel M, Pépin M. La toxoplasmose, un problème d’actualité. Point Vét. 1994 ; 26 (n° spécial “Ruminants et santé publique”) : 883-890.

- Mercier P. La listériose chez la chèvre laitière. Point Vét. 2002 ; 33 (n° spécial “Pathologie ovine et caprine”) : 90-92.

- Rodolakis A. La chlamydiose abortive des petits ruminants. Point Vét. 1997 ; 28(182) : 1215-1217.

- Rodolakis A. Chlamydiose et fièvre Q : agents d’avortements et zoonoses ? Point Vét. 1994 ; 26 (n° spécial “Ruminants et santé publique”) : 845-850.

- Tainturier D. Les maladies abortives des petits ruminants. Point Vét. 2002 ; 33(n° spécial “Pathologie ovine et caprine”) : 34-38.

- Thiry E, Buonavoglia C. La maladie des frontières chez les ovins. Point Vét. 2002 ; 33 (n° spécial “Pathologie ovine et caprine”) : 93-95.

ATTENTION

La sérologie Elisa peut être utilisée pour toutes les infections abortives, à l’exception de la salmonellose et de la campylobactériose. C’est la technique sérologique la mieux adaptée au diagnostic de la fièvre Q.

PHOTO 1. Avorton expulsé lors du dernier mois de gestation. Le moment où l’avortement se produit ne peut valablement orienter le diagnostic vers une pathologie abortive particulière.

Un kit Elisa-r (Pourquier-Montpellier) utilisant un antigène recombinant spécifique de Chlamydophila abortus permet un diagnostic très précoce et spécifique dès huit jours après l’infection expérimentale.

PHOTO 2. Divers agents abortifs (Chlamydophila abortus, Coxiella burnetii, Leptospira) peuvent occasionner des mammites.

PHOTO 3. La naissance d’agneaux chétifs présentant des retards de croissance et incapables de se tenir debout peut être symptomatique de la Border Disease.

PHOTO 4. Type morphologiques “smooth” (en bleu) et “rough” (en rouge) des colonies de Brucella.

PHOTO 5. L’épreuve de l’antigène tamponné (EAT), ou test du rose Bengale, constitue un test rapide pour le diagnostic de la brucellose. Exemple de réponses positives et négatives.

PHOTO 6. Mise en évidence des anticorps spécifiques d’un agent abortif au moyen d’anticorps anti-immunoglobulines couplés à la phosphatase alcaline (Elisa). Cette technique tend de plus en plus à remplacer la fixation du complément. Facilement automatisable, elle peut pratiquement être utilisée pour toutes les infections abortives.

PHOTO 7. Détection de différents agents abortifs par PCR multiplex. Ce résultat montre la possibilité intéressante de rechercher simultanément plusieurs agents abortifs (colonnes 4-7).

Symptômes et lésions macroscopiques pouvant être observés lors d’avortements chez les petits ruminants

Postulats de Koch

Postulats d’Evans

Caractéristiques des techniques sérologiques utilisées pour le diagnostic des avortements

Le test de référence est indiqué en rouge. EAT : Épreuve à l’antigène tamponné (= test du “rose Bengale”). IDG : Immunodiffusion en gélose. MAT : Microagglutination. IFAT : Immunofluorescence indirecte.

Critères de Fredricks et Relman (1996) pour incriminer un agent pathogène en se fondant sur la détection des acides nucléiques