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RÉSIDUS D’ANTIBIOTIQUES DANS LE LAIT
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EN QUESTIONS-RÉPONSES
Auteur(s) : Wim Reybroeck
Fonctions : Ministère de la Communauté
flamande, Département Qualité
des produits animaux
et Technologie
de la transformation (DVK-CLO),
Brusselsesteenweg 370, B-9090
Melle, Belgique
La mise en œuvre de kits de dépistage des résidus inhibiteurs chez les éleveurs laitiers demande une bonne connaissance des principes, des modes d’utilisation et de la sensibilité de ces tests.
Pour le dépistage des résidus antibiotiques dans le lait, les laboratoires interprofessionnels laitiers utilisent en France, depuis le 1er janvier 2002, un test microbiologique fondé sur l’inhibition de Bacillus stearothermophilus, le Delvotest® MCS (les échantillons positifs ou douteux étant ensuite confirmés par la seconde étape de l’ancienne méthode officielle, qui fait appel à l’inhibition de B. subtilis, B. stearothermophilus et B. megaterium). Cette méthode plus sensible conduit à appliquer plus fréquemment des pénalités pour présence de substances inhibitrices dans le lait livré à la laiterie. Ces pénalités sont appliquées avec de plus en plus de rigueur, et il n’est pas rare que les éleveurs soient confrontés à des conséquences encore plus lourdes, telles que la prise en charge de la destruction d’une citerne complète d’un camion de collecte.
Dans ce contexte, la mise en œuvre de tests simples et rapides de détection des résidus de substances anti-infectieuses dans le lait à la ferme est une mesure préventive intéressante pour éviter d’être pénalisé. Plusieurs kits de détection destinés à être utilisés à la ferme ou au cabinet vétérinaire sont actuellement commercialisés (voir le TABLEAU “Liste des distributeurs et prix indicatifs des kits de diagnostic”). Il peut s’agir de tests microbiologiques ou de tests immunologiques rapides. Cet article détaille les diverses possibilités et limites de ces kits.
Les stratégies d’utilisation de tests rapides de dépistage des inhibiteurs à la ferme ou au cabinet vétérinaire font encore l’objet de débats, que ce soit sur les modalités pratiques d’applications (lait individuel ou de mélange) et pour les décisions ou conclusions qui en découlent.
Il existait en Belgique jusqu’à une date récente une obligation de contrôle systématique des laits de tournée (au niveau du camion-citerne de la laiterie) à l’aide d’un test rapide. Cette obligation est actuellement suspendue pour une période d’un an, le temps de trouver des solutions pour la destruction des laits « contaminés ». Quelques laiteries envoient la facture de destruction du lait au producteur responsable. Pour éviter les sanctions dues à la présence de substances inhibitrices dans leur lait, de plus en plus d’éleveurs laitiers pratiquent eux-mêmes systématiquement des tests de détection de résidus antibiotiques sur leur lait de tank.
En France, la mise en œuvre des tests en élevage est envisagée de manière restreinte. Une utilisation systématique sur le lait de toutes les vaches traitées après l’expiration du temps d’attente n’est pas recommandée (elle est même contre-indiquée) lorsque le traitement a été mis en œuvre dans le cadre des indications du RCP (résumé des caractéristiques du produit) retenu dans l’AMM (autorisation de mise sur le marché). Les tests peuvent être réalisés chez des vaches traitées en cas de traitement « hors RCP », à l’issue du temps d’attente estimé, ou chez des vaches pour lesquelles il y a un doute sur les conditions de traitement et de fin du temps d’attente, ou encore sur le lait de tank en cas de doute sur le lait d’une vache qui a été traitée ou d’erreur de manipulation sur l’orientation du lait.
Les principales recommandations ont été synthétisées à l’occasion d’une conférence de consensus sur l’antibiothérapie bovine organisée par la Société française de buiatrie et le laboratoire Pfizer en 2002 (voir l’ENCADRÉ “Consensus sur l’utilisation des tests de dépistage des inhibiteurs à la ferme en France”).
Les échantillons prélevés doivent être représentatifs. Il est recommandé d’éviter d’analyser quelques jets prélevés à la mamelle ou le lait d’un quartier, par exemple. Pour l’analyse du lait d’une vache individuelle, il convient de rassembler dans un bocal ou dans un seau de traite la totalité du lait de la vache et, après l’avoir soigneusement mélangé, d’en prélever un échantillon qui sera analysé. Les tests peuvent aussi être effectués sur le lait de tank.
Les échantillons doivent toujours être prélevés dans un récipient propre.
L’utilisation des tests microbiologiques est illustrée par la présentation de deux procédures à large spectre de détection, le Delvotest® SP et le Copan® Test. Ils utilisent tous les deux Bacillus stearothermophilus var. calidolactis comme germe test et nécessitent l’emploi d’un petit incubateur.
Le Delvotest® SP (PHOTO 1) se présente sous la forme d’ampoules contenant le germe test sur milieu gélosé avec un indicateur coloré et de comprimés de milieu nutritif à incorporer dans les ampoules au moment de leur utilisation.
Après l’ajout du lait à tester, les ampoules sont placées dans un incubateur pour favoriser la croissance du germe (PHOTO 2). Si le lait ne contient aucune substance inhibitrice, le milieu nutritif vire du violet au jaune en raison de la production d’acide par le germe. Les inhibiteurs éventuellement présents dans le lait empêchent la croissance du germe et la production d’acide : dans ce cas, la couleur de l’indicateur de pH ne vire pas.
Les ampoules sont conservées au réfrigérateur (6-15 °C) dans leur emballage d’origine (boîte en polystyrène expansé). Elles ne doivent être exposés ni au gel ni à de fortes variations de température. Le film de protection des ampoules qui ne sont pas utilisées immédiatement ne doit pas être endommagé, sinon la gélose peut se dessécher et être contaminée par des bactéries.
Il existe d’autres présentations du Delvotest® (voir l’ENCADRÉ “Autres présentations du Delvotest®”), cependant, elles ne sont pas adaptées à une utilisation simple en élevage.
• Une ampoule est ouverte et un comprimé de milieu nutritif y est déposé à l’aide d’une pince. Les comprimés ne doivent jamais être touchés avec les doigts en raison d’un risque de contamination qui provoquerait un résultat faussement positif.
• 0,1 ml de lait est ajouté au moyen d’une pipette à embout jetable. Un nouvel embout de pipette doit être utilisé pour chaque échantillon. Il convient d’éviter de contaminer l’embout de pipette et les différentes ampoules entre elles.
• L’ampoule est fermée par du ruban adhésif et placée pendant trois heures dans le petit incubateur à 64 ± 1 °C. Une incubation de plus de trois heures aurait des conséquences négatives sur la sensibilité du test, en particulier vis-à-vis des sulfamides, des tétracyclines et des autres substances qui ne provoquent pas une inhibition totale du germe test.
• La couleur obtenue est observée immédiatement après l’incubation (voir la FIGURE “Nuancier Delvotest® SP”).
Il convient d’inclure dans le lot à analyser un échantillon de référence (lait sans inhibiteurs), afin de contrôler si le kit est toujours opérationnel.
Le Delvotest® SP est particulièrement sensible vis-à-vis des pénicillines, des céphalosporines et des sulfamides. Les résidus d’autres substances (tétracyclines, macrolides, aminoglycosides, etc.) sont également détectables dans le lait, mais pas au niveau de leur LMR respective (voir les FIGURES “Sensibilité du Delvotest® SP aux β-lactamines” et “Sensibilité du Delvotest® SP aux non-β-lactamines”).
Des variations de sensibilité assez importantes entre les lots ont été constatées en cours de validation du test au DVK-CLO et lors d’essais circulaires avec l’industrie laitière belge.
Le Copan® Test (PHOTO 3) associe le principe de diffusion en gélose avec la réduction d’un indicateur coloré. L’absence des substances inhibitrices est indiquée par un virement de l’indicateur. Si le lait contient des substances inhibitrices, la couleur ne vire pas.
Il se présente sous la forme d’un kit de vingt-cinq ou de cent analyses en ampoules individuelles (PHOTO 4). Les précautions pour le stockage et l’utilisation sont les mêmes que pour le Delvotest® SP. À l’intérieur du couvercle de la boîte se trouve un indicateur de chaleur qui change de couleur si le kit a été conservé à une température dépassant 40,6 °C.
Il existe également une formulation sous la forme de microplaques (4 x 96 tests). Pour cette formulation, l’incubation doit être réalisée au bain-marie ou en chaleur sèche.
• 0,1 ml de lait à tester sont introduits dans une ampoule au moyen d’une pipette à embout jetable.
• L’ampoule est fermée au moyen de ruban adhésif et placée pendant trois heures à 64 ± 0,5 °C dans le petit incubateur.
• La couleur obtenue est évaluée immédiatement après l’incubation (voir la FIGURE “Interprétation du Copan® Test”).
Le Copan® Test est également un test microbiologique à large spectre de détection, qui permet de détecter des résidus de β-lactamines et d’autres substances (voir les FIGURES “Sensibilité du Copan® Test aux β-lactamines” et “Sensibilité du Copan® Test aux non-β-lactamines”).
Un résultat de Delvotest® SP ou de Copan® Test positif indique la présence de substances inhibitrices de la croissance bactérienne, en général des résidus d’antibiotiques (y compris les sulfamides). L’inhibition de la croissance peut également être due à d’autres substances ou actions. Par exemple, les substances inhibitrices propres au lait, telles qu’un taux élevé de lactoferrine ou de lysozymes, peuvent être à l’origine d’un résultat faussement positif. Cette perturbation par les inhibiteurs naturels se manifeste souvent lors de l’analyse de lait de brebis ou de chèvre. Le Copan® Test y est nettement moins sensible que le Delvotest® SP. Des restes de désinfectants ou d’antiseptiques ou de certains vermifuges en fortes concentrations (de l’ordre du ppm) produisent le même effet.
L’analyse peut également être perturbée par un pH anormal du lait. Les vaches atteintes de mammite subclinique sont susceptibles de produire du lait au pH alcalin (> 7,2) si la barrière sang/lait est endommagée. Ce pH élevé peut générer un résultat positif.
Enfin, ces deux tests ne sont pas de type quantitatif. Un résultat positif ne permet pas de savoir si les résidus excèdent la LMR, car la substance qui provoque l’inhibition de la croissance n’est pas connue. Seule une analyse physicochimique avec identification de l’antibiotique et quantification de ses résidus peut apporter une réponse définitive.
La mise en œuvre des tests immunologiques est illustrée par la présentation du Snap® Beta Lactam, du Beta Star® et du Charm MRL® Test. Ces trois tests détectent seulement la présence des β-lactamines. Pour le Charm MRL® Test et le Snap®, il existe aussi des kits qui permettent de détecter les tétracyclines.
Comme les tests microbiologiques, ces procédures nécessitent également une phase d’incubation.
Le Snap® Beta Lactam, le Beta Star® et le Charm MRL® Test reposent sur le même principe : le lait est incubé en même temps qu’un récepteur afin que les β-lactamines éventuellement présentes puissent se lier au récepteur. Après migration, la quantité restante de récepteur libre est contrôlée par comparaison de l’intensité de la couleur de la bande test (ou du point test) avec celle d’une bande témoin (ou d’un point témoin). L’intensité de la couleur à hauteur de la zone de capture (bande ou point test) est inversement proportionnelle à la concentration de β-lactamines dans l’échantillon. La lecture est réalisée visuellement ou au moyen d’un lecteur. Lors d’utilisation du Charm MRL® Test et du Snap® Beta Lactam, il convient d’employer un lecteur car les résultats de ces tests sont difficiles à interpréter visuellement.
• Le lait est aspiré avec la pipette fournie jusqu’à la hauteur du trait (450 ± 50 µl), puis déposé dans l’éprouvette. Celle-ci est placée pendant cinq minutes à 45 °C dans l’incubateur.
• Un module encliquetable est placé dans l’évidement de l’incubateur. Le contenu de l’éprouvette est versé dans le puits prévu sur le module.
• Dès que le cercle d’activation bleu disparaît, le module est encliqueté. Après quatre minutes supplémentaires d’incubation à 45 °C, la couleur du point test est comparée à celle du point témoin (VOIR LA FIGURE “).
• Le flacon contenant le lyophilisat (récepteur spécifique lié à des particules d’or) est tapé délicatement contre une surface dure, afin de faire tomber le lyophilisat dans le fond du flacon.
• Le scellé métallique est retiré.
• Le flacon est ouvert et le bouchon en caoutchouc est conservé.
• 0,2 ml de lait est aspiré à l’aide de la pipette avec embout fournie, et déposé dans le flacon contenant le lyophilisat (un nouvel embout de pipette doit être utilisé pour chaque échantillon).
• Le flacon est refermé au moyen du bouchon en caoutchouc, puis retourné et secoué afin de dissoudre complètement le lyophilisat.
• Le flacon est mis à incuber pendant trois minutes à 47 ± 1 °C dans l’incubateur.
• La bandelette est alors placée dans le flacon, qui est laissé à incuber pendant deux minutes supplémentaires.
• Le résultat est lu sur la bandelette (voir la FIGURE “Lecture des bandelettes du Beta Star®”).
• Le couvercle de l’incubateur porté à 56 °C est ouvert.
• Une bandelette de test ouverte jusqu’à la zone adhésive bleue y est placée.
• 0,3 ml de lait est placé dans la zone de test.
• La bandelette est fermée et laissée à incuber pendant huit minutes.
• La bandelette est lue visuellement ou à l’aide d’un lecteur Rosa® (voir la FIGURE “Lecture visuelle des bandelettes du Charm MRL® Test”).
Le TABLEAU « Sensibilité des tests immunologiques aux β-lactamines » résume les résultats obtenus pour différentes molécules. La sensibilité est la concentration minimale qui donne un résultat positif dans au moins 90 % des cas.
Le développement de tests rapides de dépistage des inhibiteurs à la ferme ou au cabinet vétérinaire (de la marque Delvotest® en particulier) est encore débattu sur les modalités pratiques d’applications (lait individuel ou de mélange) et sur les décisions ou conclusions qui en découlent.
Il convient de ne pas utiliser systématiquement les tests de dépistage, notamment sur des laits individuels, lorsque l’usage du médicament est conforme aux recommandations du RCP en termes de schéma posologique et de temps d’attente.
Les limites de sensibilité des tests ne sont pas toujours en concordance avec les LMR, donc avec les temps d’attente. Une utilisation systématique pourrait conduire, à tort, à remettre en cause le calcul des temps d’attente de l’ensemble des antibiotiques autorisés et validés. Ainsi, dans la plupart des études réalisées avec des antibiotiques intramammaires, 80 à 90 % des prélèvements sont négatifs au Delvotest® dès la troisième ou la quatrième traite post-traitement, alors que les délais d’attente validés sont, pour la plupart, de six à dix traites. La compilation de résultats négatifs au Delvotest® ne peut justifier un raccourcissement des délais d’attente.
Les méthodes microbiologiques qualitatives (ou semi-quantitatives) utilisées pour le dépistage rapide des inhibiteurs ne sont pas celles qui sont validées dans les dossiers d’AMM. Pour l’obtention des AMM, les techniques analytiques physicochimiques quantitatives (et non microbiologiques) sont les seules acceptées. Il n’est donc pas surprenant qu’il n’y ait pas toujours concordance entre ces deux types de méthodes très différentes. La méthode microbiologique détecte les inhibiteurs, sans les identifier ni a fortiori les quantifier. Elle ne peut être acceptée comme une technique de référence pour la recherche de résidus en quantité supérieure aux LMR. En outre, elle est fondée sur l’acidification du lait et un changement de couleur. Elle est d’une interprétation difficile, qui dépend beaucoup de l’appréciation visuelle du virage coloré par l’utilisateur. Cette méthode détecte parfois des quantités résiduelles d’antibiotiques inférieures aux LMR. Pour des antibiotiques peu actifs vis-à-vis des ferments lactiques, elle ne les détecte qu’en quantité très supérieure aux LMR.
Les tests rapides à la ferme ou au cabinet peuvent être utiles pour prévenir la présence d’inhibiteurs lors :
- de doute, s’il y a une perte d’information sur la date du dernier traitement, un mélange accidentel du lait d’une vache sous traitement par erreur dans le tank, etc. ;
- d’usage n’ayant pas fait l’objet d’une validation, notamment lors d’usage dit « hors AMM » ou « hors RCP » (hors du résumé des caractéristiques du produit). Cet usage, qu’il soit intentionnel ou accidentel (administration d’un intramammaire destiné au tarissement pendant la lactation par exemple), introduit en effet une interrogation sur la présence d’inhibiteurs dans le lait.
Ces tests fournissent alors des informations sur la présence ou non d’inhibiteurs dans le lait testé, qu’il soit individuel ou de mélange. Mais ils n’ont aucune valeur légale et ne permettent pas de garantir l’absence totale d’inhibiteurs ni a fortiori de tout résidu médicamenteux, dans le lait individuel ou de mélange livré à la laiterie.
Extrait de « Antibiothérapie bovine et consensus », Pfizer Santé animale, 2002.
Outre Delvotest® SP en conditionnement de 25 (Delvotest® SP Mini) ou 100 ampoules, il existe une formulation sous la forme de microplaques (Delvotest® SP 5Pack, contenant 5 x 96 tests). Cette présentation nécessite l’utilisation d’un bain-marie au lieu d’un bloc chauffant pour l’incubation. Par ailleurs, il convient d’évaluer la couleur après 2 heures 45 minutes d’incubation, au lieu de trois heures pour les ampoules.
Le Delvotest® MCS, conçu spécialement pour les laboratoires interprofessionnels, n’est pas utilisable à la ferme. Sa sensibilité vis-à-vis des sulfamides et des tétracyclines est supérieure à celle du Delvotest® SP. Dans de ce test, les nutriments sont déjà intégrés au milieu gélosé. Sa stabilité et sa durée de conservation sont donc limitées, ce qui implique qu’il doive être contrôlé de manière formelle au moyen d’échantillons de contrôle (témoin positif et témoin négatif). Il existe uniquement sous la forme de microplaques et tous les lots n’ont pas le même temps de lecture, ce qui rendrait son utilisation très complexe pour les éleveurs.
- Rousseau C. Les analyses courantes réalisables au cabinet vétérinaire. Point Vét.2003 ; 34(n° spécial « Examens paracliniques chez les bovins »): 20-25.
- Vernhes R, Vandaële E. Détection rapide des inhibiteurs dans le lait. Point Vét. 2002 ; 33(227): 16-17.
L’utilisation de tests simples et rapides de détection des résidus de substances anti-infectieuses dans le lait à la ferme est une mesure préventive intéressante pour éviter les pénalités dues à la présence d’inhibiteurs.
Les kits sont destinés à l’analyse de lait de mélange : mélange des quatre quartiers pour une vache individuelle ou lait de tank.
Les tests microbiologiques (Delvotest® SP, Copan® Test) sont fondés sur l’inhibition de Bacillus stearothermophilus var. calidolactis. Leur spectre de détection est assez large.
Les inhibiteurs naturels, certains désinfectants ou des modifications de pH du lait peuvent être à l’origine de réactions faussement positives lors d’utilisation des tests microbiologiques.
Les tests immunologiques (Snap® Beta Lactam, Beta Star® ou Charm MRL® Test par exemple) ne détectent que la présence des β-lactamines.
