Le point Vétérinaire n° 236 du 01/06/2003
 

LUTTE CONTRE LA MALADIE DES MUQUEUSES CHEZ LES BOVINS

Éclairer

NOUVEAUTÉS

Éric Sellal

LSI – Le Bois Dieu
1 bis, allée de la Combe
69380 Lissieu

Grâce à la “real time PCR”, les animaux IPI et les virémiques transitoires vis-à-vis du virus BVD sont détectés sur un mélange de vingt échantillons.

Un protocole PCR (polymerase chain reaction) est validé pour la détection des animaux infectés permanents immunotolérants (IPI) et des virémiques transitoires, vis-à-vis du virus de la maladie des muqueuses (BVD), sur un mélange de vingt échantillons, y compris lorsque les veaux sont encore sous immunité colostrale.

Avec une prévalence d’IPI par cheptel de 1 à 2 % et en considérant que 20 % des élevages testés ont au moins un IPI, ce protocole réduit des deux tiers le coût des analyses par rapport aux techniques individuelles traditionnelles.

Limites des techniques “traditionnelles”

Une sérologie BVD positive ne traduit qu’un passage viral, impossible à dater précisément et d’origine variable (contamination de voisinage, présence d’un IPI dans l’exploitation, vaccin à virus vivant, etc.). Avec cette technique indirecte, seuls des facteurs de risque peuvent être définis. Ainsi, grâce à des Elisa p80 sur lait de tank tous les quatre mois, l’Union bretonne des groupements de défense sanitaire (UBGDS) classe les cheptels laitiers selon un risque BVD [1]. La sérologie permet également de réaliser un pré-screening des animaux IPI, car il est généralement admis que ces derniers sont séronégatifs en anticorps p80 après la disparition des anticorps colostraux (voir le TABLEAU “Supériorité de la technique PCR par rapport aux Elisa pour détecter les IPI”). Néanmoins, cette idée est démentie par certains auteurs [2] qui affirment que 15 % des IPI présentent des anticorps anti-BVDV p80…

Le virus ou son ARN peuvent aussi être mis en évidence directement (isolement, immunofluorescence directe ou, plus souvent, en Elisa). Utilisables sur sang total ou leucocytes, ou sur sérum, ces techniques sont faciles à mettre en œuvre. Leur sensibilité est toutefois insuffisante pour la détection des animaux IPI sous immunité colostrale (voir le TABLEAU “Supériorité de la technique PCR par rapport aux Elisa pour détecter les IPI”) et des virémiques transitoires (risque de faux négatifs).

Elles sont réservées aux prélèvements individuels et peu adaptées aux programmes régionaux de contrôle ou d’éradication.

En outre, leur spécificité (risque de faux positifs) est variable, en particulier sur le sang total, le sérum et les organes.

Gain de temps

Une nouvelle méthode de mise en évidence “directe”, la PCR “en temps réel” (“real time PCR” = RT-PCR), est disponible depuis environ deux ans. Sa sensibilité et sa spécificité sont meilleures qu’en PCR traditionnelle grâce à l’utilisation de sondes marquées fluorescentes en complément des amorces (primers). Les tubes amplifiés ne sont plus ouverts, ce qui supprime le risque de contamination du laboratoire.

Les résultats sont lus en même temps que l’amplification (“temps réel”).

Un système informatique compare objectivement les signaux quantifiables obtenus par les échantillons à analyser (fluorescence) avec ceux des contrôles négatifs et positifs analysés en même temps. Quatre-vingt-seize échantillons peuvent être traités simultanément.

Les résultats sont quantitatifs ou semi-quantitatifs.

En collaboration avec l’Institut de virologie vétérinaire de Berne, en Suisse, la firme LSI a adapté cette technique au diagnostic de la BVD [3], du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) et de la parvovirose porcine.

Tous les instruments de l’analyse (thermocycleur, faisceau laser, caméra “CCD”, plaques hermétiques) sont intégrés dans un même appareil (Abiprism 7000 par exemple).

La PCR “en temps réel” BVD, ou méthode RT-PCR Taqman®-LSI BVD, est actuellement utilisée en routine par quelques laboratoires vétérinaires en France et en Europe. Une gamme de kits Taqvet est commercialisée pour les laboratoires équipés du matériel “real time PCR”.

Résultats quantitatifs

Les résultats sont fournis par un (Rn (en ordonnée sur la courbe) qui représente la différence entre le signal spécifique émis par la sonde Taqman et le bruit de fond de fluorescence du système.

Ils sont visualisables sur un écran informatique relié à l’appareil et sont quantifiables par le Ct (Cycle threshold) en abscisse. Celui-ci correspond au nombre de cycles qui permet d’atteindre un niveau de fluorescence spécifique de la sonde (en moyenne, il est équivalent à la moyenne des contrôles négatifs + 10 écarts types). Un Ct faible correspond à une charge virale forte, et inversement. Les Ct supérieurs à 45 sont négatifs (absence de virus détectable dans l’échantillon).

Même sous immunité colostrale

Cette technique est validée sur le lait individuel, mais aussi pour la détection d’un animal IPI dans un lait de tank issu de 432 vaches. Expérimentalement, un IPI est détectable même lorsque son lait est dilué à volume égal dans 100 000 laits négatifs !

Sur sang total, un animal IPI ou virémique transitoire peut être détecté, individuellement ou sur un mélange de vingt échantillons, y compris lorsqu’il est encore sous immunité colostrale (tube EDTA impératif).

Sur sérum, animaux IPI et virémiques transitoires sont également détectables, individuellement ou sur mélange de vingt prélèvements sur EDTA (et même trente à cent selon un auteur américain [4]), mais pas avant l’âge de six mois (trop faible charge virale chez les animaux sous immunité colostrale).

Les deux catégories d’animaux – IPI et virémiques transitoires – pourraient même être distinguées en RT-PCR (résultats préliminaires sur dix veaux).

Les “infectés congénitaux”

Outre les animaux IPI, les veaux “CI” (congenital infection) sont définis comme des jeunes issus de mères infectées en fin de gestation [5]. Ils naissent séropositifs vis-à-vis du BVDV (avant la buvée colostrale), présentent des virémies faibles et longues (plusieurs mois) et des troubles cliniques variés pendant les premiers mois de vie. Ceux qui survivent deviendraient vironégatifs.

Reste à savoir la proportion entre les animaux “CI” (infection prénatale) et virémiques transitoires (infection postnatale) parmi les veaux à virémie faible et non permanente…

D’autres applications

La RT-PCR Taqman®-LSI BVD est également réalisable sur des prélèvements d’organes (rate, poumons, ganglions), sur des cellules, sur du sérum de veau fœtal, sur des antigènes vaccinaux, etc.

Des publications récentes ont ainsi confirmé [6] que 10 à 90 % des lots de sérum de veau fœtal sont contaminés par de l’ARN viral du BVDV2.

Cette technique permet aussi le génotypage du virus BVDV (distinction du BVDV1 et du BVDV2), ainsi que la détection d’inhibiteurs (matériel enzymatique présent dans l’échantillon et qui risque d’inhiber la Taq-polymérase de la PCR).

Congrès

4 - Weinstock D. RT-PCR and real time PCR Taqman diagnosis of BVD virus, Proceedings of Xe International Symposium of Veterinary Laboratory Diagnosticians. Salsamaggiore. Parma. 2001 : 149-150.

  • 1 - Joly A. Maîtrise de la BVD, grille de classification des troupeaux laitiers à partir des résultats de lait de mélange. Documentation UBGDS et GDS 56. 2001.
  • 2 - Brownlie J. Manual of standard of diagnostics tests and vaccines, OIE, Chap.X.5. 2000. Disponible sur le site http ://www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00115.htmOIE.
  • 3 - Kaiser D. Entwicklung und evaluation eines RT-Taqman-PCR Test verfahrens zum Nachweis des BVD-Virus. Thèse doctorat vétérinaire. Université de Berne (Suisse). 2001.
  • 5 - Munoz-Zanzi Claudia et coll. Quantification, risk factors, and health impact of natural congenital infection with bovine viral diarrhea virus in dairy calves. Am. J. Vet. Res. 2003 ; 64(3): 358-365.
  • 6 - Ridpath J. Segregation of bovine viral diarrhoea virus into genotypes. Virology. 1994 ; 205(1): 66-74.

Distinction entre animaux IPI et virémiques transitoires grâce à la RT-PCR

Résultats préliminairesIPI : animal infecté permanent immunotolérant ; VT : animal virémique transitoire.

Proposition d’un plan d’échantillonnage pour la détection totale des animaux IPI dans un élevage bovin (laitier ou allaitant)

Attention : pendant et après la réalisation des analyses, contrôler par la technique RT-PCR Taqman LSI les nouveau-nés et les animaux introduits.IPI : animal infecté permanent immunotolérant.

Supériorité de la technique PCR par rapport aux Elisa pour détecter les IPI

Les animaux IPI (infectés permanents immunotolérants) sont seuls susceptibles de développer une maladie des muqueuses (par recontamination ou mutation). Ils sont porteurs et excréteurs permanents de virus, d’où la nécessité de les détecter le plus précocement possible.