Recours à la PCR multiplex en clientèle et comparaison à la culture bactérienne sur le lait - Le Point Vétérinaire expert rural n° 334 du 01/04/2013
Le Point Vétérinaire expert rural n° 334 du 01/04/2013

DIAGNOSTIC DES MAMMITES EN CLIENTÈLE BOVINE

Article original

Auteur(s) : Ellen Schmitt-Van de Leemput*, Olivier Samson**, Nicolas Gaudout***, Martine Alliot****

Fonctions :
*Clinique vétérinaire Haute-Mayenne
1, rue Pasteur 53700 Villaines-la-Juhel
vetorural@wanadoo.fr
**Clinique vétérinaire Haute-Mayenne
1, rue Pasteur 53700 Villaines-la-Juhel
vetorural@wanadoo.fr
***Clinique vétérinaire Haute-Mayenne
1, rue Pasteur 53700 Villaines-la-Juhel
vetorural@wanadoo.fr
****Thermo Fisher Scientific,
division Microbiologie,
6, route de Paisy
69571 Dardilly

La réaction en chaîne par polymérase en temps réel PathoProof®, qui permet de rechercher 12 agents pathogènes dans un échantillon de lait, a été comparée à l’analyse bactériologique classique d’une clientèle vétérinaire en Mayenne (France).

La plupart des infections intramammaires des vaches laitières sont dues à des bactéries. Savoir identifier ces agents pathogènes est essentiel pour sélectionner les traitements curatifs et les mesures préventives adaptés. À ce jour, la méthode de référence (gold standard) est la mise en culture bactériologique d’un échantillon de lait prélevé dans le ou les quartiers infectés.

L’amplification génique polymerase chain reaction (PCR, réaction en chaîne par polymérase) est une autre possibilité. La cible de l’analyse est alors l’ADN de la bactérie. Récemment, une méthode standardisée PCR en temps réel a été développée, visant spécifiquement l’identification des agents pathogènes mammaires les plus importants (PathoProof® Mastitis PCR Assay, Thermo Fisher Scientific).

Diverses études ont comparé la culture bactériologique avec cette réaction en chaîne par polymérase en temps réel (Rt-PCR) PathoProof® [5, 7, 10]. Elles concluent à des résultats identiques dans la plupart des cas sur des échantillons issus de mammites cliniques comme subcliniques, mais des bactéries qui ne sont pas détectées en bactériologie classique sont identifiées avec PathoProof® [9, 10].

Nous avons étudié le kit PathoProof® dans sa version “12 agents pathogènes” (PF0870) dans les conditions de laboratoire d’une clinique vétérinaire rurale spécifiquement équipée (encadré).

PRINCIPE DU KIT MULTIPLEX RT-PCR ÉTUDIÉ

Les échantillons de lait sont d’abord soumis à un procédé d’extraction pour libérer l’ADN de la bactérie avant d’initier la réaction PCR proprement dire (figure). Les fragments d’ADN qu’il s’agit d’amplifier sont sélectionnés grâce à des amorces incluses dans le kit PCR. Celles-ci sont choisies de façon à générer des fragments spécifiques de chacune des bactéries à identifier dans l’analyse. Pour chaque PCR, un témoin négatif d’extraction et un autre de PCR sont inclus. En fin de réaction standardisée PCR, le logiciel de l’ordinateur relié à l’analyseur indique la présence de la bactérie d’une façon semi-quantitative. La quantité est indiquée en nombre de cycles d’amplification nécessaires à mettre en œuvre pour produire des copies d’un fragment d’ADN en quantité suffisante, afin que le signal dépasse une valeur seuil préétablie (valeurs C(t) seuil pour chaque bactérie, tableau 1).

En pratique, 4 heures environ sont nécessaires pour réaliser l’extraction et la réaction de la PCR. Un peu plus de la moitié sont des heures actives (c’est-à-dire correspondant à des manipulations de la part de l’opérateur, et non à un temps d’attente).

COMPARAISON ENTRE RT-PCR PATHOPROOF® ET LA CULTURE BACTÉRIOLOGIQUE

Notre étude en clientèle des souches bactériennes identifiées avec PathoProof® ou avec la culture classique a été organisée autour de quatre types de prélèvements. Les échantillons de lait ont été réalisés par les vétérinaires praticiens ou les éleveurs, comme d’habitude dans notre clientèle. Ceux sur les vaches à taux cellulaires élevés ont été effectués exclusivement par le vétérinaire, pendant la traite, dans le cadre de la réalisation des profils d’élevage. Les analyses PCR PathoProof® sont effectuées au sein du laboratoire de la clinique vétérinaire Haute-Mayenne.

1. Sur des souches préisolées en culture bactérienne

D’abord, la PCR a été étudiée vis-à-vis de souches bactériennes qui avaient été isolées auparavant en culture bactériologique classique (n = 20 pour chacune) [8]. Les échantillons ne contenaient donc qu’une seule bactérie parmi les suivantes : Escherichia coli, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulase negative. Toutes les bactéries ont été identifiées de la même manière avec la PCR et la culture, et aucune bactérie supplémentaire n’a été mise en évidence avec PathoProof®.

2. Sur des échantillons de lait de mammite clinique

Dans un second temps, les analyses ont été réalisées en doublon sur des laits de mammite clinique bovine. Pour 23 des 25 échantillons ainsi testés (92 %), les bactéries identifiées en culture et en PCR sont identiques, avec la plus petite valeur de C(t). Pour les deux échantillons restants, les mêmes bactéries ont été identifiées, mais pas avec la plus petite valeur de C(t). En outre, des bactéries supplémentaires ont été détectées avec PathoProof®. Celles seulement identifiées en PCR l’ont été en petite quantité (grande valeur de C(t), tableau 2).

Les données publiées rapportent des résultats similaires. Dans une étude comparative, la PCR amenait à 70 % d’échantillons de lait contenant plus d’un agent pathogène, tandis qu’en culture le pourcentage n’était que de 32 % [5].

3. Sur des échantillons de cas de mammite subclinique

Pour la culture bactériologique sur des échantillons de lait de mammite subclinique, assez fréquemment (30 à 40 % des analyses dans notre laboratoire), aucune bactérie n’est détectée (échantillons qualifiés de “stériles”) [10].

Dans notre étude, des échantillons issus de mammite subclinique et fournissant des résultats soit positifs, soit négatifs en culture bactériologique classique ont été soumis à la PCR. Pour ceux positifs (tout comme pour ceux issus de mammite clinique), les mêmes conclusions que précédemment peuvent être formulées. Les mêmes bactéries sont découvertes avec les deux méthodes, mais davantage sont identifiées avec la PCR (tableau 3). Dans 20 cas sur 28 analyses (71 %), celle identifiée en culture a été trouvée en PCR avec les plus basses valeurs de C(t).

Plus surprenant, pour les échantillons de lait de mammite subclinique à culture négative, dans 18 cas sur 26, la PCR a permis de détecter des bactéries mammaires, et bien souvent des bactéries majeures (n = 11, E. coli, S. uberis ou S. aureus) (tableau 4). Cette observation corrobore les données publiées (47 % de résultats qui donnent l’avantage à la PCR pour des agents pathogènes majeurs dans l’étude de Bexiga et coll., en 2011) [2].

4. Comparaison de laits de quartiers à comptage cellulaire somatique élevé ou bas

Les résultats PCR de laits de quartiers à comptage cellulaire somatique (CCS) élevé ou bas ont été comparés (> 200 000 ou < 100 000 cellules somatiques/ml, méthode DCC Delaval®, respectivement n = 18 et n = 20). La PCR n’a détecté aucune bactérie dans 74 % des échantillons à bas comptages cellulaires, comparés à 12 % des échantillons de lait à hauts comptages cellulaires. En moyenne, 1,4 et 2,2 différentes bactéries ont été détectées respectivement dans les bas et les hauts comptages cellulaires. Les données disponibles dans les publications rapportent que 7 % des échantillons de quartiers à bas taux cellulaires étaient positifs avec PathoProof® PCR (contre 4 % en culture) [5].

UTILISATION DE LA PCR “AGENTS PATHOGÈNES MAMMAIRES” EN ELEVAGE

L’utilisation du lait de tank pour détecter la présence de bactéries de mammites susceptibles d’infecter les vaches individuellement a déjà été testée avec la culture bactériologique. En théorie, cette méthode est fiable pour les bactéries contagieuses non présentes dans l’environnement. PathoProof® est décliné dans une version spécialement dédiée à la détection de trois de ces bactéries dans le lait de tank (Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus et Mycoplasma bovis) [3, 6]. Il est moins évident de recourir au lait de tank pour détecter les bactéries à composante plus environnementale telles S. uberis, E. coli et Staphylococcus spp. En outre, l’identification d’une bactérie dans le lait de tank n’indique pas le nombre de vaches ou de quartiers infectés par une bactérie, ni la vache positive.

Dans notre étude, PathoProof® PCR a été utilisé pour analyser un échantillon de lait de tank et 10 prélèvements de lait issus de 10 vaches d’un même cheptel, tous réalisés le même jour. Pour sélectionner les quartiers à échantillonner, des tests California Mastitis Test (CMT) sont effectués chez des vaches à CCS élevés au contrôle de performance (> 200 000 cellules/ml). Pour chacune d’elles, le quartier qui réagit le plus fort au CMT était prélevé. Les cheptels comportaient de 40 à 60 vaches laitières (tableau 5). En général, les bactéries détectées dans le lait de tank sont aussi identifiées dans les échantillons individuels, sauf pour l’élevage noir (Staphylococcus. spp.). L’interprétation quantitative des résultats est plus difficile. La présence d’une bactérie chez un grand nombre de vaches n’est pas toujours associée à la détection de cette bactérie en quantité importante dans l’échantillon de lait de tank.

En s’appuyant sur nos quelques résultats et sur ceux publiés, la conclusion n’est pas différente lorsque PathoProof® PCR ou la culture bactériologique sont utilisés [4]. Les analyses sur lait de tank sont une façon séduisante de suivre la qualité du lait dans un élevage. Toutefois, elles ne permettent pas de prédire systématiquement ce qui se passe à l’échelon individuel.

Les profils d’élevage issus d’analyses PCR portant sur plusieurs échantillons de lait d’une même exploitation prélevés simultanément peuvent être un outil nouveau et intéressant pour le suivi sanitaire en élevage. La PCR est extrêmement sensible, contrairement à la bactériologie qui génère beaucoup, voire trop, de prélèvements positifs. La bactériologie manque de sensibilité, surtout pour les prélèvements des vaches à mammites subcliniques. Elle possède donc un intérêt limité pour la réalisation de profils d’élevage. Il est souvent impossible de conclure à la présence d’une bactérie dominante sur la base d’un grand nombre de prélèvements “stériles”. En raison de sa trop grand sensibilité, la PCR est difficile à interpréter pour un échantillon isolé mais trouve toute son utilité pour la détermination de profils d’élevage. L’analyse simultanée des résultats de plusieurs prélèvements d’un même élevage permet de différencier les bactéries réellement présentes sur une majorité d’animaux et celles qui pourraient être rangées dans une catégorie “faux positifs” à l’échelle du cheptel, car seulement présentes chez quelques individus.

Ainsi, pour chaque ferme, une ou plusieurs bactéries dominantes peuvent être identifiées, en combinant les résultats PCR de toutes les vaches. Pour la ferme bleue de cette étude, il s’agit de S. aureus et E. coli. Pour la rouge, S. uberis et, pour la noire, C. bovis et S. spp. ont été identifiées conjointement. De préférence, la lecture et l’interprétation des profils d’élevage sont effectuées par quelqu’un qui a une bonne connaissance de l’épidémiologie des agents pathogènes mammaires dans un élevage.

La PCR identifie une multitude de bactéries, en plus ou moins grande quantité. Si l’une d’elles est présente en très faible quantité dans un échantillon isolé, cela peut n’avoir aucune signification à l’échelle de la vache. En revanche, une bactérie en faible quantité sur les prélèvements d’une majorité des vaches d’un cheptel peut indiquer que sa présence est importante à l’échelle de l’élevage. Toute bactérie retrouvée dans un quartier participe à la meilleure compréhension de la dynamique de l’infection bactérienne mammaire dans le troupeau.

EMPLOI DE LA PCR EN CLIENTÈLE

1. Aspect pratiques

Les méthodes diffèrent sur le délai d’obtention des résultats et les temps de manipulation. Quatre heures suffisent pour obtenir un résultat (y compris la procédure d’extraction), alors qu’environ 24 heures sont nécessaires pour une culture bactériologique. Toutefois, le temps de manipulation avec la PCR est de 2 à 4 heures, tandis que pour une culture, 5 minutes suffisent par échantillon. Avec la PCR, en multipliant les échantillons analysés simultanément (jusqu’à 22), le temps de manipulation n’est pas augmenté, tandis qu’avec la bactériologie, les temps de réalisation s’additionnent.

En pratique vétérinaire, la culture bactériologique s’intègre parfaitement à l’organisation classique des tâches, alors que, pour mettre en œuvre PathoProof® PCR, une personne est requise une demi-journée. L’équipement, les conditions de travail sont à réfléchir spécifiquement. La plupart du temps, PathoProof® PCR vise des conditions de laboratoire spécialisées.

2. Aspects scientifiques

La PCR détecte davantage d’espèces ou de genres bactériens que la culture bactérienne. Différentes études ont été publiées ou sont en cours pour mieux comprendre les modalités d’interprétation des résultats obtenus [1]. Est-ce l’ADN de bactéries mortes qui est amplifié, d’où le fait que la culture ne les détecte pas ? S’agit-il de contaminants de l’environnement ? Ces bactéries proviennent-elles de la peau du trayon ou des mains de la personne qui a prélevé l’échantillon ? Sont-elles vraiment issues du lait et, si c’est le cas, ont-elles un impact sur la qualité du lait dans cet élevage ?

Selon notre interprétation, la présence de bactéries différentes en faible quantité complique l’interprétation des prélèvements individuels. En revanche, pour établir des profils d’élevage, leur identification peut être extrêmement utile. Le fait qu’elles soient détectées, même en faible quantité, chez un grand nombre de vaches est une donnée intéressante. Davantage de recul expérimental est nécessaire pour confirmer ces observations préliminaires.

Dans les conditions actuelles de notre exercice, nous optons pour la bactériologie classique pour l’analyse d’échantillons de lait issus de cas de mammite clinique. La possibilité d’initier l’analyse à n’importe quelle heure du jour et n’importe quel jour de la semaine rend les résultats plus rapidement disponibles que pour la PCR, même si le process de cette dernière est, en théorie, plus rapide. De plus, en l’état actuel des connaissances sur la signification des résultats obtenus avec la PCR, cette technique n’apporte pas d’informations supplémentaires susceptibles d’améliorer la prise en charge thérapeutique d’un cas isolé de mammite clinique. Toutefois, pour les échantillons de lait de mammite subclinique, nous utilisons PathoProof® PCR dès que cela est possible, en analysant simultanément un maximum de prélèvements issus d’une ferme donnée (photo). Les profils d’élevage sont en train d’être intégrés à notre abord de la gestion sanitaire. Une analyse d’échantillons individuels de toutes les vaches à fort CCS dans l’élevage (au maximum 10), à un temps donné, est proposée. La PCR est mise en œuvre un jour fixe de la semaine, sachant que les résultats ne sont pas urgents pour l’établissement des profils.

Conclusion

La PCR multiplex pour l’analyse des prélèvements de lait dans les cas d’infections mammaires en élevages laitiers est une nouveauté utile dans la gestion de la qualité du lait en élevage. Comparée à celle de la bactériologie classique, son interprétation est parfois difficile et les résultats ne sont pas toujours superposables. Sa meilleure sensibilité par rapport à la bactériologie mérite d’être approfondie et exploitée pour l’établissement de profils d’élevage.

Références

  • 1. Bexiga R, Pereira H, Pereira O et coll. Observed reduction in recovery of Corynebacterium spp. from bovine milk samples by use of a teat cannula. J. Dairy Res. 2011;78(1):9-14.
  • 2. Bexiga R, Koskinen MT, Holopainen J et coll. Diagnosis of intramammary infection in samples yielding negative results or minor pathogens in conventional bacterial culturing. J. Dairy Res. 2011;78(1): 49-55.
  • 3. Justice-Allen A, Trujillo J, Goodell G et coll. Detection of multiple Mycoplasma species in bulk tank milk samples using real-time PCR and conventional culture and comparison of test sensitivities. J. Dairy Sci. 2011;94(7):3411-3419.
  • 4. Katholm J, Bennedsgaard TW, Koskinen MT et coll. Quality of bulk tank milk samples from Danish dairy herds based on real-time polymerase chain reaction identification of mastitis pathogens. J. Dairy Sci. 2012;95(10):5702-5708.
  • 5. Koskinen MT, Wellenbert GJ, Sampimon OC et coll. Field comparison of real-time polymerase chain reaction and bacterial culture for identification of bovine mastitis bacteria. J. Dairy. Sci. 2010;93:5707-5715
  • 6. Mweu MM, Toft N, Katholm J et coll. Evaluation of two herd-level diagnostic tests for Streptococcus agalactiae using a latent class approach. Vet. Microbiol. 2012;159:181-186.
  • 7. Paradis ME, Haine D, Gillespie B et coll. Bayesian estimation of the diagnostic accuracy of a multiplex real–time PCR assay and bacteriological culture for 4 common bovine intramammary pathogens. J. Dairy Sci. 2012;95:6436-6448.
  • 8. Schmitt–Van de Leemput EE, Schmitt-Beurrier A. Examens complémentaires lors de mammites chez la vache : bactériologie sur le lait en clientèle. Point Vét. 2005;255:52-53.
  • 9. Spittel S, Hoedemakers M. Mastitis diagnosis in dairy cows using PathoProof® real-time polymerase chain reaction assay in comparison with conventional bacterial culture in a Northern German field study. Berl. Munch Tierarztl. Wochenschr. 2012;125:494-502.
  • 10. Taponen S, Salmikivi L, Simojoki H et coll. Real-time polymerase chain reaction: base identification of bacteria in milk samples from bovine clinical mastitis with no growth in conventional culturing. J. Dairy Sci. 2009;92:2610-2617.

Conflit d’intérêts

Les kits PathoProof® utilisés dans cette étude ont été fournis par Thermo Fischer Scientific.

ENCADRE
Bactéries recherchées avec PathoProof® mammite version 12 (ou 16) agents pathogènes

PathoProof® mammite version 12

→ Escherichia coli

→ Klebsiella oxytoca/pneumoniae

→ Corynebacterium bovis

→ Staphylococcus aureus

→ Staphylococcus spp.

→ Streptococcus uberis

→ Streptococcus dysgalactiae

→ Streptococcus agalactiae

→ Enterococcus spp.

→ Arcanobacterium pyogenes/Peptoniphilis indolicus

→ Serratia marcescens

→ Gène Β-lactamase staphylococcique

PathoProof® mammite version 16

Bactéries de PathoProof® mammite version 12 + Mycoplasma bovis, Mycoplasma spp , levures et Prototheca spp.

Points forts

→ La PCR multiplex développée spécifiquement pour la détection des agents pathogènes mammaires est un outil diagnostique nouveau, jugé utile pour l’établissament de profils d’élevage.

→ La lecture et l’interprétation des profils d’élevage impliquent une bonne connaissance de l’épidémiologie des agents pathogènes mammaires dans un cheptel.

→ La culture bactériologique s’intègre facilement dans l’organisation d’une clinique vétérinaire, alors que la PCR nécessite un équipement et une organisation du travail plus spécifiques.

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