Le point Vétérinaire Canin n° 350 du 01/11/2014
 

IMMUNOLOGIE CANINE ET FÉLINE

Article de synthèse

Benoît Rannou

Laboratoire de biologie médicale, VetAgro Sup
1, avenue Claude-Bourgelat
69280 Marcy-L’Étoile
benoit.rannou@vetagro-sup.fr

Les tests d’autoagglutination et de Coombs direct sont très utiles lors de suspicion d’anémie hémolytique à médiation immune. Le test de Coombs indirect est utilisé pour rechercher des allo-anticorps.

Résumé

→ Le test d’autoagglutination et les tests de Coombs, direct et indirect, sont utilisés dans le cadre du diagnostic de l’anémie hémolytique à médiation immune (AHMI). Le test d’autoagglutination est un examen que le vétérinaire praticien peut facilement mettre en œuvre à la clinique, mais qui n’est intéressant que si une autoagglutination est détectée au frottis. Le test de Coombs direct est à réaliser au laboratoire et permet de détecter la présence d’anticorps ou de fractions du complément à la surface des hématies sans qu’une autoagglutination soit nécessairement présente. Ces deux tests permettent donc de confirmer le caractère immun d’une anémie. Le test de Coombs indirect permet, quant à lui, de différencier les autoanticorps des anticorps dirigés contre des xéno-antigènes.

Summary

Autoagglutination test and Coombs tests in dogs and cats

→ The autoagglutination test and direct and indirect Coombs tests are used in the diagnosis of immune-mediated haemolytic anaemia (IMHA). The autoagglutination test is a test that the veterinary practitioner can easily implement in the clinic, but is only useful if autoagglutination is detected in the smear. The direct Coombs test is performed in the laboratory and allows detection of the presence of antibodies or complement proteins on the surface of red blood cells without autoagglutination being necessarily present. Both tests can therefore confirm the immune nature of the anaemia. The indirect Coombs test allows differentiation of autoantibodies from antibodies directed against xeno-antigens.

Key words

Haematology, haemolytic anaemia, agglutination, Coombs immunity

L’anémie hémolytique à médiation immune est une affection hématologique qui touche aussi bien le chat que le chien et dont le pronostic est généralement réservé [6, 7]. Elle se caractérise par un état d’hyperhémolyse dû à la présence à la surface des hématies, et parfois dans le plasma, d’anticorps dirigés contre des déterminants antigéniques localisés sur la membrane de celles-ci.

Son diagnostic, fondé sur l’anamnèse et les signes cliniques présentés par l’animal, nécessite le recours à des tests de laboratoire. Ces derniers permettent de confirmer l’origine immune de l’anémie, puis d’en déterminer la cause (infectieuse, néoplasique, etc.) (tableau). En effet, la présence de nombreux sphérocytes ou d’agglutination au frottis sanguin, ainsi qu’un test d’autoagglutination sur lame ou un test de Coombs positif permettent de conclure à une origine à médiation immune de l’anémie. L’objectif de cet article est de présenter le test d’autoagglutination et les tests de Coombs, direct et indirect, en indiquant pour chacun leur réalisation pratique, leur intérêt et leurs limites.

TEST D’AUTO­AGGLUTINATION SUR LAME

Le test d’autoagglutination est un examen simple qui peut être réalisé à la clinique ou au laboratoire, et qui est utilisé lors de suspicion d’anémie hémolytique à médiation immune (AHMI). Il permet de confirmer la suspicion d’agglutinats observés au frottis (photo 1).

1. Quand le réaliser ?

Physiopathologie de l’autoagglutination

À l’état physiologique et en milieu salin, il existe entre les hématies une différence de potentiel électrique (potentiel ξ) qui s’oppose à leur agrégation. Lors d’AHMI, la présence d’anticorps à la surface des hématies modifie le potentiel ξ et peut entraîner leur autoagglutination [9].

Ainsi, l’observation d’une autoagglutination (macroscopique ou microscopique) est pathognomonique d’une AHMI puisqu’elle se produit quand des anticorps dits “complets” ou “agglutinants” sont présents en quantité suffisante à la surface des hématies. Ces anticorps sont le plus souvent des immunoglobulines M (IgM) et parfois des immunoglobulines G (IgG). C’est donc une liaison dite “forte”, de type antigène-anticorps, qui s’établit généralement entre les hématies.

Toutefois, ces agglutinats ne sont pas systématiquement observés lors d’AHMI car tous les anticorps ne sont pas suffisamment efficaces ou nombreux pour provoquer une agglutination (anticorps dits “incomplets”). Ainsi, la présence d’agglutinats est rapportée dans 42 à 87 % des cas d’AHMI chez le chien, selon les études, et comme fréquente chez le chat [1, 2, 5, 8, 11]. Une autoagglutination peut être observée dès la prise de sang (à température corporelle) ou seulement lorsque le sang est refroidi, ce qui est le cas le plus fréquent (optimum à + 4 °C).

Différencier les rouleaux et les agglutinats

Les agglutinats doivent être différenciés des rouleaux d’hématies qui correspondent à des cellules alignées à l’image de pièces de monnaie empilées (photo 2). Les liaisons entre les hématies sont, dans ce cas, faibles. Ces rouleaux s’observent à l’examen de frottis de chats sains, ainsi que chez certains chiens sains. Ils sont également notés lors d’hyperglobulinémie due à un foyer inflammatoire ou à une tumeur lymphoïde. Quand ils sont présents en grande quantité, il est parfois difficile de les différencier des agglutinats.

Pour distinguer les rouleaux des agglutinats ou, plus simplement, pour confirmer une suspicion d’autoagglutination, le test d’autoagglutination correspond à l’examen de laboratoire de choix. Ce dernier consiste à ajouter quelques gouttes de sérum physiologique à une goutte de sang : sous l’effet de la dilution, les rouleaux disparaissent spontanément alors que les agglutinats formés grâce à des IgM se maintiennent.

2. Comment le réaliser ?

Dans un tube sec en verre ou en plastique, une goutte de sang prélevé sur anticoagulant qui complexe le calcium (tube EDTA ou citraté) est mélangée avec trois à cinq gouttes de sérum physiologique (NaCl à 0,9 %). Une ou deux gouttes du mélange sont ensuite déposées sur une lame. L’agglutination peut alors s’observer macroscopiquement, mais il est toujours préférable de confirmer cette autoagglutination au microscope en plaçant le mélange entre lame et lamelle (observation à l’objectif x 10, puis x 40 en abaissant le condenseur).

3. Comment l’interpréter ?

Persistance des amas d’hématies

Si, à l’examen macroscopique ou microscopique, des amas d’hématies persistent, une autoagglutination consécutive à la présence d’anticorps (le plus probablement des IgM) à leur surface est très probable (photos 3 et 4). Cela est fortement en faveur d’une anémie hémolytique à médiation immune. Certains auteurs rapportent cependant qu’une autoagglutination s’observe parfois lors d’anémie dont l’origine n’est pas immune [2].

Disparition des amas d’hématies

Lorsqu’à l’examen macroscopique les amas disparaissent ou que les hématies forment un tapis monocellulaire à l’examen microscopique, c’est qu’elles correspondent très probablement à des rouleaux (photos 5 et 6). Cependant, la possibilité que ces amas soient des agglutinats ne peut être exclue. En effet, si les anticorps recouvrant les hématies sont des IgG, l’autoagglutination est également susceptible de disparaître à la suite d’une dilution avec du sérum physiologique [3].

Le test d’agglutination a donc une bonne valeur prédictive positive (c’est-à-dire qu’un résultat positif est très en faveur d’une AHMI). En revanche, l’autoagglutination n’est pas forcément présente lors d’AHMI. Ce test n’est donc pas toujours réalisable. De plus, il peut être négatif avec certains types d’immunoglobulines, lors d’anémie très sévère et à la suite de l’administration de glucocorticoïdes. Le test d’agglutination a donc une valeur prédictive négative moyenne (un résultat négatif ne permet pas d’exclure une AHMI).

TEST DE COOMBS DIRECT

Le test de Coombs direct est également appelé “test direct à l’antiglobuline”. Il a été mis au point en 1945 par un vétérinaire immunologiste, Robin Coombs, et a tout d’abord été utilisé chez l’homme pour mettre en évidence des anticorps dirigés contre les antigènes Rhésus (Rh) présents à la surface des hématies des individus de groupe Rhésus positif [10]. En médecine vétérinaire, ce test est réalisé au laboratoire et couramment mis en œuvre pour rechercher des anticorps ou des fractions du complément à la surface des hématies d’un animal.

1. Quand le réaliser ?

Comme indiqué précédemment, la présence d’anticorps à la surface des hématies n’entraîne pas toujours une autoagglutination visible macroscopiquement ou au frottis. Le test de Coombs permet de provoquer cette agglutination en utilisant un réactif particulier : l’antiglobuline.

Le test de Coombs est donc mis en œuvre dans les cas où une AHMI primaire (idiopathique) ou secondaire (à un processus infectieux, néoplasique, à la prise de médicaments, etc.) est suspectée. Il est particulièrement intéressant lorsque les autres examens de laboratoire ne permettent pas de conclure de façon certaine à une origine immune (aucune évidence d’autoagglutination, sphérocytes absents ou en faible nombre, ou non identifiables, comme c’est souvent le cas dans l’espèce féline, par exemple). Le test de Coombs direct n’est pas nécessaire lorsqu’une autoagglutination est objectivée par un test d’agglutination puisque ces deux examens apportent la même information : des anticorps sont fixés à la surface des hématies.

Ce test est également intéressant pour le suivi de traitement des anémies hémolytiques à médiation immune.

2. Principe du test de Coombs direct

Le principe du test de Coombs est de provoquer une agglutination des hématies sensibilisées (c’est-à-dire recouvertes d’anticorps anti-hématies) en utilisant un réactif (l’antiglobuline) qui contient des anticorps dirigés contre les immunoglobulines de l’espèce de l’animal testé. Les anticorps anti-immunoglobulines servent de ponts entre les hématies recouvertes d’anticorps anti-hématies (figure 1).

L’antiglobuline utilisée est spécifique de l’espèce étudiée. Ce réactif est un anticorps polyclonal de chèvre ou de lapin immunisés par des immunoglobulines (G ou M) ou du complément de l’espèce à laquelle le test de Coombs est destinée. Ainsi, une trousse de dosage pour médecine humaine ne peut pas être utilisée pour le chien et, de même, une trousse de dosage canine est inadéquate chez le chat. En médecine vétérinaire, des trousses sont disponibles pour les espèces canine, féline et équine.

L’antiglobuline est, de plus, généralement polyvalente, c’est-à-dire qu’elle contient à la fois des anti-IgG, des anti-IgM, et des anticomplément (fraction C3). Il existe également des réactifs monovalents (seulement anti-IgG, ou anti-IgM, ou anti-C3) permettant d’augmenter la spécificité du test, mais qui en diminue parallèlement la sensibilité.

3. Réalisation pratique

En pratique, le test de Coombs est réalisé avec du sang prélevé sur anticoagulant qui complexe le calcium (tube EDTA ou citraté). Il est conseillé d’acheminer ce tube de sang total rapidement (dans les 24 heures) et sous couvert du froid. Cependant, une étude récente incluant 11 chiens avec un test de Coombs positif et 23 chiens avec un test de Coombs négatif a montré que ces résultats restaient inchangés sur des prélèvements conservés à + 4 °C pendant 7 jours [2].

Une fois au laboratoire, les hématies de l’animal sont séparées du plasma et préparées de manière à obtenir une suspension de travail (souvent une solution saline). La suspension de travail est ensuite mise à incuber (généralement 1 heure à 37 °C) avec l’antiglobuline à différentes concentrations afin d’obtenir une gamme de dilution. Cette gamme permet une appréciation quantitative de la sensibilisation érythrocytaire, tout en évitant les faux négatifs liés au phénomène de zone (ce dernier a lieu paradoxalement quand le nombre d’immunoglobulines fixées sur les hématies est tellement élevé qu’il ne permet pas la fixation des anticorps du réactif). Le “titre” obtenu correspond à la dernière dilution pour laquelle une agglutination est observée (figure 2).

4. Comment l’interpréter ?

Valeur prédictive positive

Le test de Coombs direct présente une bonne valeur prédictive positive, c’est-à-dire qu’il existe peu de résultats faussement positifs [10]. Les faux positifs sont rapportés chez des animaux présentant des hyperglobulinémies (secondaires à des foyers inflammatoires chroniques ou à des tumeurs lymphoïdes). En revanche, la réalisation d’une transfusion préalablement au test de Coombs ne semble pas entraîner de faux positifs [2].

Chez un chien ou un chat présentant des signes cliniques et biologiques en faveur d’une AHMI, un test de Coombs direct positif peut donc être considéré comme très en faveur d’une telle anémie. Il ne permet cependant pas de déterminer si l’AHMI est primaire ou secondaire (à un processus infectieux ou néoplasique, par exemple). La spécificité du test peut être augmentée en utilisant des réactifs monospécifiques, ce qui, de plus, caractérise les anticorps impliqués dans la lyse des hématies.

Sensibilité

La sensibilité du test de Coombs direct est moyenne puisqu’elle varie de 50 à 80 % selon les études [4, 6, 8, 10]. Un test de Coombs direct négatif ne permet donc pas d’exclure une anémie hémolytique à médiation immune.

Les causes de faux négatifs sont variées : délai d’acheminement trop long, réactifs non adaptés à l’espèce étudiée, effet de zone (lorsque la quantité d’anticorps présents à la surface des hématies est trop faible ou, à l’inverse, très importante, l’agglutination peut être inhibée), test réalisé incorrectement, quantité de complément à la surface des hématies trop faible. Les traitements immunosuppresseurs (glucocorticoïdes, azathioprine, etc.) ont également été rapportés comme possiblement à l’origine de faux négatifs. Toutefois, dans une étude récente, 12 chiens sur 16 présentant un test de Coombs direct positif étaient sous traitement immunosuppresseur [2].

Pour augmenter la sensibilité, le test peut être réalisé à froid, ce qui permet de mettre en évidence des anticorps qui ont une activité à froid et une tendance à s’éluer (c’est-à-dire à se détacher des hématies) spontanément à + 37 °C.

TEST DE COOMBS INDIRECT

Le test de Coombs indirect est un examen de laboratoire qui vise à rechercher les anticorps anti-hématies circulants présents chez le malade. Il est fréquemment utilisé en médecine vétérinaire dans le cadre des transfusions (pour la recherche d’allo-anticorps), mais est rarement mis en œuvre dans le cadre du diagnostic des AHMI (pour la recherche d’autoanticorps).

1. Réalisation pratique

Pour ce test, le sérum du malade est utilisé. Il est incubé avec des hématies saines placées dans une suspension de travail. La procédure est ensuite la même que pour un test de Coombs direct (figure 3).

2. Comment l’interpréter ?

Un test de Coombs indirect positif permet de conclure à la présence d’anticorps circulants dirigés contre les hématies. Ces anticorps sont de type autoanticorps (anticorps dirigés contre le soi) ou allo-anticorps (anticorps post-transfusionnels antiantigènes des groupes sanguins ou anticorps d’origine maternelle).

À l’inverse, un test de Coombs indirect négatif ne permet pas d’écarter la présence d’anticorps anti-hématies dirigés contre des xéno-antigènes (médicaments, micro-organismes) se trouvant à la surface des hématies.

Le test de Coombs indirect est utilisé en médecine humaine avant une transfusion sanguine. Il permet, en effet, de détecter la présence d’anticorps incomplets éventuellement présents dans le sérum d’un patient et dirigés contre les hématies du donneur. Il est bien moins pratiqué en médecine vétérinaire et n’est mis en œuvre que dans l’espèce canine pour différencier les autoanticorps et les anticorps dirigés contre les xéno-antigènes.

Conclusion

Le test d’agglutination et le test de Coombs direct sont deux examens de base qui, quand ils sont positifs, confirment la nature immune d’une anémie. En revanche, ils ne permettent pas d’en déterminer l’origine : auto-immune ou secondaire à une cause sous-jacente (processus infectieux, néoplasique, etc.). La cause de l’AHMI doit donc être explorée par d’autres outils diagnostiques (sérologie, PCR [polymerase chain reaction], imagerie médicale, etc.).

Le test de Coombs peut également être utilisé pour le suivi des AHMI : sa négativation, associée à une normalisation des paramètres hématologiques, permet de conclure à une rémission.

Références

  • 1. Carr AP, Panciera DL, Kidd L. Prognostic factors for mortality and thromboembolism in canine immune-mediated hemolytic anemia: a retrospective study of 72 dogs. J. Vet. Intern. Med. 2002;16(5):504-509.
  • 2. Caviezel LL, Raj K, Giger U. Comparison of 4 direct Coombs’ test methods with polyclonal antiglobulins in anemic and nonanemic dogs for in-clinic or laboratory use. J. Vet. Intern. Med. 2014;28(2):583-591.
  • 3. Chabanne L. Le test de Coombs direct : prélèvement et interprétation chez le chien et le chat. Nouv. Prat. Vét. 2004;hors-série “Diagnostic”:137-140.
  • 4. Day MJ. Immune-mediated anemias in the dog. In: Schalm’s Veterinary Hematology. Weiss DJ, Wardrop KJ, eds. Blackwell Publishing, Ames, Iowa. 2010:216-225.
  • 5. Kohn B et coll. Primary immune-mediated hemolytic anemia in 19 cats: diagnosis, therapy, and outcome (1998-2004). J. Vet. Intern. Med. 2006;20 (1):159-166.
  • 6. Mitchell K, Kruth S. Immune-mediated hemolytic anemia and other regenerative anemias. In: Textbook of internal veterinary medicine. Ettinger SJ, Feldman EC, eds. Saunders, St. Louis. 2010:761-782.
  • 7. Piek CJ et coll. Idiopathic immune-mediated hemolytic anemia: treatment outcome and prognostic factors in 149 dogs. J. Vet. Intern. Med. 2008;22 (2):366-373.
  • 8. Stokol T. Immune-mediated anemias in the cat. In: Schalm’s Veterinary Hematology. Weiss DJ, Wardrop KJ, eds. Blackwell Publishing, Ames, Iowa. 2010:226-232.
  • 9. Wardrop KJ. Coombs’ testing and its diagnostic significance in dogs and cats. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 2012;42(1):43-51.
  • 10. Wardrop KJ. The Coombs’ test in veterinary medicine: past, present, future. Vet. Clin. Pathol. 2005;34(4):325-334.
  • 11. Weinkle TK et coll. Evaluation of prognostic factors, survival rates, and treatment protocols for immune-mediated hemolytic anemia in dogs: 151 cases (1993-2002). J. Am. Vet. Med. Assoc. 2005;226(11):1869-1880.

Conflit d’intérêts

Aucun.

Points forts

→ Le test d’autoagglutination permet de confirmer la présence d’agglutinats au frottis.

→ Un test de Coombs direct positif avère le caractère immunologique d’une anémie.

→ Un test de Coombs direct négatif ne permet pas d’écarter complètement l’hypothèse d’une anémie hémolytique à médiation immune.

→ Le test de Coombs indirect permet de différencier une anémie hémolytique auto-immune d’une anémie hémolytique à médiation immune due à des xéno-antigènes.

1. Agglutinats sur frottis sanguin de chien (flèches), coloration de Wright-Giemsa, objectif x 100, huile à immersion.

FIGURE 1
Principe du test de Coombs direct positif

D’après [4].

FIGURE 2
Test de Coombs avec dilutions successives

La suspension de travail contenant les hématies de l’animal est mélangée à des dilutions successives d’antiglobuline. Les animaux 1 et 3 présentent des tests de Coombs fortement positifs. À l’inverse, l’examen de l’animal 4 est négatif et celui de l’individu 2, très faiblement positif. L’animal 5 présente un test avec un effet de zone : la positivité n’apparaît qu’à une dilution élevée.

FIGURE 3
Principe du test de Coombs indirect positif

2. Rouleaux sur frottis sanguin de chat (flèches), coloration de Wright-Giemsa, objectif x 100, huile à immersion.

3. Test d’agglutination macroscopique positif. Vue macroscopique.

4. Test d’agglutination microscopique positif. Vue microscopique (objectif x 20).

5. Absence d’agglutinats macroscopiques

6. Absence d’agglutinats microscopiques. Les hématies forment un tapis monocellulaire (objectif x 20).

TABLEAU
Principales causes rapportées comme possiblement responsables d’une anémie hémolytique secondaire

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