Comment optimiser un prélèvement histologique ou cytologique

Le laboratoire d’histologie est un allié précieux dans la pratique vétérinaire quotidienne, aussi bien pour le diagnostic des processus tumoraux que pour celui des processus infectieux ou dysmétaboliques, quelle que soit l’espèce considérée.

Le laboratoire est à même d’établir des diagnostics sur une multitude de prélèvements issus de l’animal (^{figure 1}). Ces derniers se répartissent en trois grandes catégories : les pièces d’exérèse, les biopsies et les cytoponctions. Ces prélèvements doivent être accompagnés d’une feuille de commémoratifs dûment remplie car la précision du diagnostic peut en dépendre (^{figure 2}, ^{figure 3}).

Cependant, il arrive que les résultats obtenus soient “décevants” ou non représentatifs. Voici quelques clés permettant au praticien d’optimiser ses prélèvements afin d’augmenter l’efficacité du diagnostic histologique (tableaux 1a, 1b, 1c et 1d complémentaires sur www.WK-Vet.fr)).

UN PRÉREQUIS MAJEUR : LA FEUILLE DES COMMÉMORATIFS

Ce document constitue le lien entre le praticien et le pathologiste. Afin que les deux parties tirent un maximum d’informations des prélèvements envoyés, cette fiche doit être scrupuleusement remplie.

→ L’espèce animale doit être indiquée car chacune présente des entités différentes concernant les processus tant inflammatoires, tumoraux que dysmétaboliques.

→ La race est précisée car elle revêt une importance particulière concernant la prédisposition à certaines tumeurs ou affections (astrocytomes fréquemment rencontrés chez le boxer, dermatomyosite souvent décrite chez le border collie, etc.).

→ L’âge est mentionné s’il est connu (par exemple, le langerhansome ou la cellulite juvénile canine touchent majoritairement des chiens jeunes).

→ Le sexe et la stérilisation éventuelle peuvent également avoir leur importance en raison de l’hormonodépendance de certaines maladies (hyperplasie prostatique, tumeurs mammaires) ou du mode de transmission lié au chromosome X (hémophilies A et B, immunodéficience liée à l’X).

→ Les antécédents médicaux sont à fournir, s’ils sont connus du clinicien. Cela est essentiel lors de la découverte de métastases d’une tumeur primaire, dont l’exérèse a déjà été effectuée.

→ Le statut vaccinal doit être précisé car certains vaccins peuvent provoquer des réactions indésirables, voire délétères (locales ou systémiques). Par exemple, les commémoratifs de vaccination sont les bienvenus lors de suspicion d’un fibrosarcome félin interscapulaire.

→ L’indication de l’organe prélevé est parfois une aide précieuse pour le diagnostic, notamment lorsque seule la tumeur a fait l’objet de la procédure, sans tissu sain qui permette d’identifier la région anatomique concernée.

→ La localisation exacte du prélèvement est capitale, notamment lors de sites cutanés. En effet, la peau présente de nombreuses variations d’aspect morphologique selon la région concernée (peau fine du ventre, couche cornée abondante des coussinets, présence ou non de glandes sudoripares).

→ Le nombre de prélèvements doit être renseigné dans le cas de biopsies, afin que le pathologiste s’assure d’en avoir analysé la totalité.

→ Les commémoratifs cliniques (aspect macroscopique, examens hématologiques, biochimiques, radiologiques et échographiques, durée d’évolution) permettent au pathologiste de replacer les lésions observées dans un contexte global, afin d’élaborer un schéma pathogénique explicite.

→ Toute thérapeutique administrée est précisée car elle est susceptible de modifier l’aspect des lésions (disparition des bactéries sous antibiotiques et des parasites sous antiparasitaires, hépatopathie vacuolaire induite par les corticostéroïdes). La réponse au traitement est également un renseignement précieux.

→ Enfin, des hypothèses cliniques doivent être émises car l’examen histopathologique peut confirmer une suspicion, mais la réfutation des propositions peut aussi servir à la compréhension du processus pathologique.

Une fiche de commémoratifs bien remplie permet d’intégrer les résultats dans des analyses rétrospectives. C’est ainsi que sont mises en lumière des prédispositions raciales ou sexuelles à certaines affections, ou l’évolution d’une maladie émergente. Plus globalement, une épidémiosurveillance à une échelle locale ou nationale peut reposer sur ce genre de données.

COMMENT PRÉLEVER ET CONDITIONNER UNE PIÈCE D’EXÉRÈSE ?

La valeur du diagnostic sur pièce d’exérèse est déterminée par différents facteurs, notamment une taille adaptée, une localisation judicieuse du site de prélèvement et une fixation de bonne qualité.

Pour les prélèvements dont la taille est inférieure à 2 cm de diamètre, la pièce d’exérèse est envoyée dans son intégralité. Une pièce plus volumineuse doit être préalablement sectionnée. En effet, le formol ne pénètre le tissu que dans une faible épaisseur (environ 1 cm pour du tissu compact).

Le prélèvement envoyé doit systématiquement inclure la zone de transition entre le tissu sain et le tissu lésionnel, quelle que soit la suspicion clinique ou la localisation de la lésion. En effet, l’examen de cette région de transition est capital car c’est là où siègent les lésions les plus récentes (et les plus spécifiques) du processus pathologique en cours. Dans le cas d’une lésion de nature tumorale, cette zone périphérique fournit de nombreuses informations, notamment sur la malignité de la tumeur (caractère infiltrant, emboles, etc.). De même, en cas de suspicion de malignité, et lorsqu’il peut être prélevé, le nœud lymphatique de drainage est joint afin d’établir le bilan d’extension histologique ganglionnaire (par exemple, envoi d’une chaîne mammaire avec les nœuds lymphatiques inguinaux ou axillaires).

Les pièces d’exérèse doivent être placées dans un flacon contenant du formol (solution commerciale tamponnée de formaldéhyde à 10 %). Il est fondamental de respecter un rapport d’au moins 10 entre le volume de formol et celui de la pièce à fixer. De grandes pièces d’exérèse sont très souvent placées dans un très faible volume de formol, et cela entraîne une fixation défectueuse. Or, dans un prélèvement mal fixé, le processus d’autolyse se poursuit, ce qui rend difficile son traitement technique et altère la qualité du diagnostic (dégradation de la morphologie cellulaire, développement bactérien). Il convient d’adapter le conditionnement au transport de matériel formolé (^{photo 1}). Il doit être fermé et étanche car le formol est un fixateur cancérogène, irritant, corrosif et sensibilisant [⁶]. Ce produit représente donc un danger potentiel pour le transporteur, ainsi que pour les techniciens de laboratoire concernés. L’enveloppe postale doit être homologuée, par exemple un Colissimo substance biologique (^{photos 2a} et ^2b).

BIOPSIES : COMBIEN, COMMENT, OÙ ET QUAND ?

1. Nombre de biopsies

Quelles que soient la lésion et sa localisation (cutanée, hépatique, rénale, intestinale), la multiplication des zones de biopsie permet d’augmenter les chances que le prélèvement examiné soit représentatif du processus pathologique en cours et de la totalité des structures histologiques de l’organe (espace porte et veine centro-lobulaire pour le foie, glomérule et tubes contournés proximaux et distaux pour le rein, muqueuse et sous-muqueuse pour le système digestif) [²-⁵]. Il n’existe donc pas de limites. Une biopsie ne constitue qu’une infime partie de l’organe (pour le foie 1/50 000^e du volume) [³]. Il convient donc de multiplier les prélèvements, d’accroître leur taille et de fournir des éléments permettant une interprétation correcte des lésions par le pathologiste (informations cliniques, hématologiques, biochimiques, échographiques, etc.).

2. Taille des biopsies

Les biopsies doivent être de la plus grande taille possible et inclure des zones représentatives. En effet, très souvent, elles sont trop superficielles et ne ciblent pas les lésions d’intérêt permettant d’établir le diagnostic. C’est pourquoi, dans la mesure du possible (localisation de la lésion, état général de l’animal, hypothèses cliniques, temps, matériel), la biopsie doit comprendre les structures histologiques essentielles de l’organe. La peau, le rein et le foie se prêtent aux prélèvements de plus grande taille (1 à 2 cm de diamètre), à condition d’avoir exclu une coagulopathie et de suturer le lieu de la biopsie (fil résorbable monofilament 4.0) [³, ⁴].

Par exemple un diagnostic de carcinome gastrique est difficile si le prélèvement ne concerne que l’épithélium de l’estomac : dans ce cas, les cellules tumorales siègent majoritairement dans la muqueuse et la sous-muqueuse. Certaines lésions hépatiques sont régionalisées et orientent le diagnostic : les lésions d’origine toxique sont souvent de localisation centro-lobulaire, alors que celles qui sont consécutives à un shunt hépatique sont majoritairement visibles dans les espaces portes. Ces exemples illustrent l’importance de l’examen d’une biopsie de grande taille.

3. Profondeur et localisation des biopsies

Lorsque la lésion à biopser mesure plus de 1 cm de diamètre, il est possible que le centre, nécrosé ou fibrosé, ne présente que peu d’intérêt diagnostique. Des prélèvements doivent donc être effectués, si possible, en périphérie, notamment dans la zone de transition entre le tissu lésionnel et le tissu sain (^{figure 3figure 3}, ^{photos 3a} et ^3b à ⁵). Dans le cadre d’une suspicion de tumeur, cette région est capitale pour le pathologiste et le praticien : elle renseigne sur le caractère infiltrant ou non du processus, et sur la présence éventuelle d’emboles vasculaires. Lors de biopsie cutanée, il convient de prélever également une zone saine (à moins que la lésion d’intérêt ne soit diffuse), afin de bénéficier d’un contrôle interne et de permettre au pathologiste de distinguer l’aspect physiologique de l’aspect pathologique. Par exemple, lors de lésion se manifestant par un trouble de la pigmentation cutanée (en hypo- ou en hyper-), il est nécessaire d’avoir pour référence une zone saine. Il en va de même pour les dysplasies folliculaires ou les alopécies.

4. Quand pratiquer une biopsie ?

Il est souhaitable de réaliser les biopsies le plus précocement possible et sur les lésions les plus récentes. Ces dernières, souvent les plus représentatives, sont localisées en périphérie, à la frontière avec le tissu sain. Les lésions chroniques ne présentent que peu de spécificité : les phases précoces du processus pathologique, souvent spécifiques et riches en informations, ont parfois disparu, laissant place à des remaniements tissulaires importants non représentatifs.

La biopsie est souvent proposée comme un examen de deuxième intention, parfois après la mise en place d’une thérapeutique susceptible de modifier l’aspect lésionnel de certains organes (hépatopathie cortico-induite, par exemple). l’arrêt de tout traitement 15 jours avant l’opération est conseillé.

5. Limites des biopsies

Le prélèvement par biopsie est certes rapide et peu invasif, mais, pour certains organes, des prélèvements de plus grande taille, voire, parfois, une exérèse de l’organe entier doivent lui être préférés. Par exemple, les biopsies hépatiques larges permettent au pathologiste de mieux apprécier l’architecture du foie et d’affiner considérablement le diagnostic. Les biopsies ganglionnaires sont souvent peu lisibles et parfois non conclusives. De plus, certaines lésions ne se prêtent pas à un prélèvement par biopsie. C’est le cas notamment des tumeurs mammaires (hors carcinomatose ou carcinome inflammatoire), surtout chez le chien (en raison de leur fréquente hétérogénéité) et des tumeurs péri-anales hépatoïdes. Le caractère infiltrant de la lésion visible sur la pièce d’exérèse complète constitue un critère décisif de malignité de la tumeur (^{tableau 2}).

ET LES CYTOPONCTIONS ?

La cytoponction est un examen secondaire visant principalement deux objectifs : l’exploration de masse et celle de liquide.

1. Cytoponction de masse, de nœud lymphatique

La cytoponction de masse suit les mêmes règles que les prélèvements biopsiques : multiplication des prélèvements pour plus de représentativité et exploration des zones lésionnelles périphériques. Cette technique, peu invasive, donne parfois des résultats décevants, souvent pour des raisons de faible spécificité du prélèvement. En effet, une concordance entre les résultats cytologiques et histopathologiques n’est rapportée que dans 30 % des cas chez le chien et 51 % des cas chez le chat [⁶].

Matériel à utiliser

Le matériel adapté est variable selon la consistance et la nature de l’organe à prélever : aiguille de 21G à 25G et seringue de 3 à 20 ml [⁶]. D’une façon générale, plus le tissu à ponctionner est mou, plus l’aiguille et la seringue sont de petite taille. À titre d’exemple, la cytoponction d’un nœud lymphatique chez un chien est réalisée à l’aide d’une aiguille de 24G et d’une seringue de 3 ml. Les tissus plus fermes (fibrome, carcinome épidermoïde) requièrent une seringue de plus grande taille (aspiration plus forte) et une aiguille de diamètre plus élevé. Cependant, la limite est atteinte avec des aiguilles de diamètre supérieur à 21G⁽¹⁾ qui augmentent le risque de contamination sanguine [⁶].

Une cytoponction peut être effectuée avec ou sans aspiration (^{tableau 3}). Les cellules ainsi récoltées sont déposées sur la lame et l’étalement se fait doucement par écrasement-étirement (^{figure 4}). L’étalement est pratiqué immédiatement après le prélèvement pour éviter le dessèchement des cellules.

Malgré toutes ces précautions, les étalements ne permettent pas toujours d’établir le diagnostic (^{tableau 4}).

2. Cytoponction de liquide

Pour les prélèvements liquides, le délai d’acheminement par Colissimo classique altère souvent les prélèvements. C’est pourquoi un étalement extemporané est fortement recommandé.

Tous les liquides prélevés peuvent être étalés directement sur une lame. Cependant, certains d’entre eux, peu cellulaires, requièrent une centrifugation préalable pour une lecture efficace (épanchements, liquide synovial, cérébro-spinal). Dans ce cas, une centrifugation de 165 à 360 g (ou l’équivalent en rotations par minute figurant sur la notice de l’appareil) pendant 5 minutes est effectuée. Le surnageant est récupéré, et le culot cellulaire est remis en suspension dans une petite quantité de celui-ci et ensuite étalé sur une lame [¹]. Cette technique permet d’augmenter artificiellement la cellularité du prélèvement et, ainsi, de maximiser les chances de diagnostic. La technique la plus adaptée à l’analyse cytologique des liquides est la cytocentrifugation (ou cytospin). Toutefois, peu de vétérinaires disposent d’un tel équipement. Il est donc possible de réaliser cette cytocentrifugation au sein du laboratoire à condition que le liquide prélevé soit expédié dans un délai de 24 h (par Chronopost) et sous couvert du froid (à 4 °C), afin de limiter au maximum la dégradation des cellules.

Pratiquement, le liquide prélevé est pipeté et une goutte est déposée sur la lame puis étalée doucement, afin d’éviter les artéfacts (noyaux nus) (^{figure 5}).

Quelle que soit la cytoponction, une fois l’étalement réalisé, les lames doivent être séchées à l’air libre : ne jamais employer de fixateur (ni de “laque”). Les vapeurs de formol sont prohibées, sous peine de faire subir aux cellules des modifications artéfactuelles irréversibles, empêchant leur identification. Donc, lorsqu’un envoi contient simultanément une pièce d’exérèse formolée et des lames non colorées, il convient de prévoir deux colis séparés.

Il est toujours préférable d’envoyer les lames non colorées dans une boîte de transport garantissant leur intégrité (^{photo 6}). Les colorations se font au laboratoire, qui possède un savoir-faire assurant une lisibilité optimale du prélèvement (choix des colorations, colorants de bonne qualité, etc.). Le délai et la température ne sont en aucun cas des facteurs altérant les lames non colorées : les cellules étalées, une fois séchées à l’air libre et conditionnées dans leur boîte de transport, sont relativement stables.

D’autres méthodes de prélèvement moins fréquentes peuvent également être utilisées (^{tableau 5}). L’examen cytologique des ponctions de masses liquidiennes (abcès, kystes, etc.) est souvent peu informatif. En effet, le liquide kystique est souvent un produit de sécrétion paucicellulaire. Lors de la ponction d’un abcès, une analyse bactériologique est préférée à une analyse cytologique.

Le matériel nécessaire est souvent fourni gratuitement par le laboratoire sur simple demande (feuille de commémoratifs, kit de prélèvement et boîte de transport pour les lames).

Conclusion

L’efficacité et la précision du diagnostic histologique dépendent :

– de la bonne réalisation des prélèvements (en adéquation avec les hypothèses cliniques et la faisabilité) ;

– de prélèvements quantitativement et qualitativement adaptés ;

– d’un bon conditionnement ;

– de la précision et de l’exhaustivité des commémoratifs, permettant de replacer les lésions observées dans un contexte plus global.

Pour toute question relative à cette pratique (façon de procéder, type de prélèvements, organes appropriés, etc.) ou en cas de doute, il convient de s’informer de la marche à suivre auprès du pathologiste vétérinaire, surtout dans des circonstances particulières.

Références

• 1. Cowell RL, Tyler RD, Meinkoth JH. Diagnostic cytology and hematology of the dog and cat. 2^nd ed. Ed. Mosby. 1999.
• 2. Mansell J, Willard MD. Biopsy of the gastrointestinal tract. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 2003; 33(5): 1099-1116.
• 3. Rothuizen J, Twedt DC. Liver biopsy techniques. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 2009; 39(3): 469-480.
• 4. Vaden SL. Renal biopsy : methods and interpretation. Vet. Clin. North Am. Small Anim. Pract. 2004; 34(4): 887-908.
• 5. Washabau RJ, Day MJ, Willard MD et coll. WSAVA International Gastrointestinal Standardization Group. Endoscopic, biopsy, and histopathologic guidelines for the evaluation of gastrointestinal inflammation in companion animals. J. Vet. Intern. Med. 2010; 24(1): 10-26.
• 6. www.inrs.fr